一種利用重組大腸桿菌制備雞白介素2的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種利用重組大腸桿菌制備雞白介素2 的方法。
【背景技術(shù)】
[000引 白細(xì)胞介素-2 (interle址in2,比-2)是T細(xì)胞和自然殺傷性細(xì)胞（NK細(xì)胞）產(chǎn) 生的糖蛋白，是動(dòng)物體內(nèi)一類重要的細(xì)胞因子，具有激活淋己因子活化的殺傷細(xì)胞和自然 殺傷細(xì)胞，刺激T輔佐細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和促進(jìn)細(xì)胞因子的繁殖，在機(jī)體 的免疫應(yīng)答中起重要作用。
[0003] 人和許多哺乳動(dòng)物IL-2的研究發(fā)展很快，已廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療和疫苗 免疫，而雞比-2研究發(fā)展相對較慢，1997年，Sundick和Gill-Dixon通過構(gòu)建CDNA文庫 的方法，首次從ConA活化的T淋己細(xì)胞中獲得了雞的比-2cDNA，為雞比-2的研究打開了 局面。之后，國內(nèi)的眾多研究者則相繼克隆出了固始雞、蕭山雞、白羽烏骨雞等十多個(gè)地方 品種雞的IL-2基因。目前，已實(shí)現(xiàn)了雞IL-2基因借助大腸桿菌、酵母或真核細(xì)胞進(jìn)行表 達(dá)。在W上表達(dá)方式中，利用大腸桿菌作為表達(dá)載體穩(wěn)定性較高、工藝易于控制，應(yīng)用最為 廣泛，然而由于雞白介素2表達(dá)基因存在較多的大腸桿菌稀有密碼子，因此影響了產(chǎn)率。
[0004] 針對此問題，諸多研究者嘗試通過基因改造對表達(dá)體系進(jìn)行改良，并取得了突出 的成果，其中本申請人通過替換雞白介素2天然表達(dá)基因中的大腸桿菌稀有密碼子使得重 組大腸桿菌對雞白介素2的表達(dá)得到了顯著的提升（CN104561021A)，然而由于基因重組后 大腸桿菌與野生型相比其生理特性發(fā)生了變化，因此如果繼續(xù)沿用野生型菌株的培養(yǎng)條件 往往不能有效表達(dá)雞白介素2蛋白；此外，應(yīng)當(dāng)針對雞白介素2表達(dá)基因的特性匹配適宜的 表達(dá)條件，從而提升重組大腸桿菌對雞白介素2的表達(dá)效率。而且，對于表達(dá)產(chǎn)物的后續(xù)純 化也需要根據(jù)基因工程菌的特性、蛋白的特性進(jìn)行具體設(shè)計(jì)。在上述技術(shù)問題層面，由于需 要針對具體情況進(jìn)行適應(yīng)性研究，因此現(xiàn)有技術(shù)中尚缺乏一種針對性且高效的利用重組大 腸桿菌制備雞白介素2的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種雞白介素2表達(dá)基因改造方法、 利用該方法改造得到的基因，W解決現(xiàn)有技術(shù)中利用重組大腸桿菌表達(dá)雞白介素2產(chǎn)率較 低的技術(shù)問題。
[0006] 本發(fā)明解決的另一技術(shù)問題是提升W重組大腸桿菌所表達(dá)的雞白介素2蛋白的 純化效率。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)W上技術(shù)目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0008] -種利用重組大腸桿菌制備雞白介素2的方法，包括W下步驟：
[0009] 1)W異丙基-0 -D-硫代化喃半乳糖巧為誘導(dǎo)物對重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)， 誘導(dǎo)濃度為0. 8~1.Ommol/l，誘導(dǎo)溫度為30~37°C，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為4~6小時(shí)；
[0010] 2)取步驟I)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，裂解獲得包涵體，加入變性緩沖液溶解變性，而 后再加入復(fù)性緩沖液進(jìn)行稀釋復(fù)性；
[0011] 3)取步驟2)復(fù)性后的蛋白執(zhí)行層析純化。
[0012] 優(yōu)選的，步驟2)所述變性緩沖液包括W下成分：45~55mMTris-肥1，7~9M 化ea，8~12mMDTT，0. 8~1. 2mM邸TA。在此基礎(chǔ)上可W進(jìn)一步分別執(zhí)行W下優(yōu)選：調(diào)整 所述變性緩沖液抑至7. 8~8. 2 ;變性緩沖液的加入量為8~12mL/g包涵體；變性條件為 在2~6°C條件下變性22~26h。
[0013] 優(yōu)選的，步驟2)變性后，離屯、收集上清而后再向上清液中加入復(fù)性緩沖液復(fù)性。
[0014] 優(yōu)選的，步驟2)所述復(fù)性緩沖液包括W下成分：17~23mMTris-HCl, 1. 8~2. 2M 化ea，0. 8~1. 2mM脫氨酸，2. 8~3. 2mM半脫氨酸；在此基礎(chǔ)上可W進(jìn)一步分別執(zhí)行W下優(yōu) 選：調(diào)整所述復(fù)性緩沖液抑至7. 8~8. 2 ;復(fù)性緩沖液的加入量滿足W下條件：加入復(fù)性緩 沖液總量后，溶液中蛋白濃度為0. 08~0. 12mg/mL;復(fù)性條件為：在2~6°C、攬拌條件下， 加入所述復(fù)性緩沖液，復(fù)性22~26h，其中攬拌轉(zhuǎn)速可W優(yōu)選為200~30化pm，而加入方式 可W優(yōu)選為非一次性的加入，例如可W是分若干次加入。
[0015] 優(yōu)選的，復(fù)性后離屯、收集上清，對上清執(zhí)行層析純化。
[0016] 優(yōu)選的，步驟3)所述層析為陰離子交換層析，上樣后、洗脫目的蛋白之前，先W 1. 8~2. 2倍柱體積的含有0. 04~0. 06M化Cl、18~22mMTris-肥1的溶液洗脫雜蛋白， 該溶液抑可W優(yōu)選為7. 8~8. 2 ;在此基礎(chǔ)上可W進(jìn)一步分別執(zhí)行W下優(yōu)選：所用層析填 料為QSe地arose化StFlow;用于洗脫目的蛋白的溶液包括W下成分：0.4~0.6M化Cl, 18~22mM化is-肥1，所述用于洗脫目的蛋白的溶液其抑可W優(yōu)選為7. 8~8. 2。
[0017] 優(yōu)選的，所述重組大腸桿菌的雞白介素2表達(dá)基因W地V220、pET系列載體或P犯 系列載體的任一種作為表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)選為祀T-28a(+)表達(dá)載體。
[0018]優(yōu)選的，所述重組大腸桿菌的菌種為大腸桿菌D冊a、大腸桿菌化21值63)或大腸 桿菌JM109。
[0019] 在W上任一技術(shù)方案基礎(chǔ)上優(yōu)選的，所述重組大腸桿菌中的雞白介素2表達(dá)基因 是在雞白介素2天然表達(dá)基因的基礎(chǔ)上W大腸桿菌非稀有密碼子替換其中的大腸桿菌稀 有密碼子，所得到的基因。
[0020] 進(jìn)一步優(yōu)選的，其特征在于所述雞白介素2表達(dá)基因，在其所表達(dá)的蛋白質(zhì)N端對 應(yīng)的核巧酸上連接有信號(hào)膚或利用表達(dá)載體上的信號(hào)膚，所述信號(hào)膚為pelB或ompT的其 中一種、為祀T表達(dá)載體所帶、位于多克隆位點(diǎn)N端。
[0021] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述雞白介素2表達(dá)基因，在其末端具有標(biāo)簽蛋白，所述標(biāo)簽蛋白 為His標(biāo)簽、Arg標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽或GST標(biāo)簽的其中一種。
[0022] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述雞白介素2表達(dá)基因的序列如SEQIDN02所示。
[0023]本發(fā)明所述的重組大腸桿菌專指已經(jīng)整合有雞白介素2表達(dá)基因的基因重組大 腸桿菌；上述雞白介素2表達(dá)基因既可W是天然基因序列也可W是適當(dāng)改良的、不影響 所表達(dá)蛋白的核巧酸序列的人工基因序列；上述"整合有"是指該基因能夠在該重組大腸 桿菌中順利表達(dá)，可W但不限于存在于質(zhì)粒上或核區(qū)基因上。W上技術(shù)方案中所述的Q Se地aroseFastFlow層析填料是一種商品名，具體限定為由美國GE公司出品的型號(hào)為Q Se地aroseFastFlow的層析填料。在W上技術(shù)方案中，單位"M"和"ml"分別指"mol/L" 和"mmol/L"，化ea指尿素，DTT是指二硫蘇糖醇。
[0024] 本發(fā)明提供的方法及基因?qū)？卺槍υ吮磉_(dá)系統(tǒng)，尤其是W大腸桿菌為宿主的表 達(dá)系統(tǒng)，因此本發(fā)明的基因改造方法是在雞白介素2天然表達(dá)基因的基礎(chǔ)上將其中大腸桿 菌的稀有密碼子替換為非稀有密碼子，從而提升了大腸桿菌對雞白介素2及其衍生蛋白的 表達(dá)效率。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過對雞白介素2表達(dá)基因密碼子的取代、添加或缺失實(shí)現(xiàn) 了改造后基因所表達(dá)的蛋白具有雞白介素2的生物活性。
[002引本發(fā)明提供的序列如SEQIDN02所示的基因與雞白介素2天然表達(dá)基因的核巧 酸數(shù)量均為366個(gè)，所表達(dá)的蛋白其氨基酸序列相同。利用該基因所表達(dá)的雞白介素2蛋 白雖在大腸桿菌中W包涵體的形式表達(dá)，但較高的表達(dá)量及后續(xù)的簡易復(fù)性、純化工藝，彌 補(bǔ)了運(yùn)一劣勢，具有產(chǎn)量、復(fù)興率及回收率高的優(yōu)點(diǎn)，且生產(chǎn)周期短，成本低，為雞白介素2 的規(guī)模化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明針對該表達(dá)系統(tǒng)的自身特性匹配了特定的工藝條 件，通過對蛋白變性、復(fù)性W及純化方法的創(chuàng)新設(shè)計(jì)使得利用該方法能夠高效的表達(dá)雞白 介素2并能獲得高純度蛋白，具有突出的技術(shù)優(yōu)勢。
【附圖說明】
[0026] 圖1是雞白介素2天然表達(dá)基因（化IL-2-腳序列與本發(fā)明SEQIDN02序列 (ChIL-2-O)對比圖；
[0027] 圖2是瓊脂糖凝膠電泳檢測化IL-2-0基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中M為Marker,Ll 為PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，L2為陰性對照。
[0028] 圖3是SDS-PAGE檢測誘導(dǎo)后與未經(jīng)誘導(dǎo)的化IL-2蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)結(jié) 果，其中M為非預(yù)染蛋白Marker。
[0029] 圖4是SDS-PAGE檢測化IL-2蛋白的變復(fù)性結(jié)果，其中M為非預(yù)染蛋白Marker。
[0030] 圖5是SDS-PAGE檢測化IL-2蛋白的離子交換層析結(jié)果，其中M為非預(yù)染蛋白 Marker,Ll為上樣流穿液，L2為平衡緩沖液洗涂的雜蛋白，L3為洗脫緩沖液洗脫的蛋白，L4 為清洗柱子的洗脫物。
[0031] 圖6是化IL-2蛋白促雞外周血T淋己細(xì)胞增殖的活性檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0032] W下將對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在 W下實(shí)施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0033] W下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用"大約"、"左右"等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn) 確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十（10%)的 范圍內(nèi)變化，比如，"大約100"表示的可W是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第 一數(shù)值到第二數(shù)值"的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近 似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。
[0034] 除有定義外，W下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員普遍理解的相同含義。
[0035] W下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn) 方法，如無特