日本黃姑魚線粒體全基因組序列的擴增引物及其擴增方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種日本黃姑魚線粒體全基因組序列的擴增引物及其擴增方法。
【背景技術(shù)】
[0002]日本黃姑魚(Nibea japonic)俗稱黑毛鱷，#盧形目(Perciformes)，石首魚科(Sciaenidae)，黃姑魚屬{Nibed}(朱元鼎，1963 ;成慶泰1987)，為一種大型優(yōu)質(zhì)食用魚類，主要分布于中國東海、南海及日本南部沿海。
[0003]日本黃姑魚為大型食用魚類，最大的個體可以達到1.5米以上，能適應不良環(huán)境和抵御疾病能力強，易于養(yǎng)殖，餌料系數(shù)低，生長迅速，是重要的海水養(yǎng)殖品種，也是增殖放流的主要對象之一。由于其較高的經(jīng)濟價值，日本黃姑魚承受的捕撈壓力一直有增無減。近年來，由于東海區(qū)資源量下降，對日本黃姑魚的資源增殖工作引起人們的重視。線粒體基因組是生物重要的遺傳物質(zhì)，其中后生動物線粒體DNA為典型的環(huán)狀雙鏈分子結(jié)構(gòu)，長度大多在14-18kb之間，編碼37個基因，包括13個蛋白質(zhì)基因、22個tRNA以及12S rRNA和16S rRNA (ffolstenholme DR，1992，)。線粒體DNA是核外遺傳物質(zhì)，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳等特點，成為生物多樣性、群體遺傳學與系統(tǒng)進化研究中的重要分子標記(Miya M and Takeshima H，2003 ；Lavou S and Miya M，2007)。目前，線粒體基因已作為種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析的重要分子標記，并且線粒體ND2、16SrRNA與Cyt b基因、D-1oop序列已被應用于水產(chǎn)動物中貝類(蘇天鳳2007;汪桂玲2009)、甲殼類(王成輝，2008)、魚類(李林，2011 ;蔣宗良，2011)物種遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。迄今為止還沒有對日本黃姑魚的線粒體基因組序列、遺傳和種質(zhì)資源鑒定與保護相關(guān)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種日本黃姑魚線粒體全基因組序列的擴增引物，通過20對特異性引物對日本黃姑魚基因組進行PCR擴增獲得日本黃姑魚線粒體全基因組序列，可為日本黃姑魚的保護遺傳學、進化遺傳學及優(yōu)良養(yǎng)殖品種的分子標記輔助選擇提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種日本黃姑魚線粒體全基因組序列的擴增引物，包括20對引物對，具體序列信息如下所示:
(1)第I對上游引物為:SEQID N0.1所示的核苷酸序列(5’ -CTTCAAGGCTGTTATACGCACACC-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.2 所示的核苷酸序列(5’- GCCAGGTCTTGTTTGGAGAGTTC_3，)；
(2)第2對上游引物為:SEQID N0.3所示的核苷酸序列(5’ -CATTTTTCCTCCCAAGTACG-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列(5’-TGGAGGCTGCAGTTGCTTGT-3’ )； (3)第3對上游引物為:SEQID N0.5所示的核苷酸序列(5’ -GCGCTAGCCTACTTCTTCAG-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列(5’-TCTATGGCTTGGAGGAAAGT-3’ )；
(4)第4對上游引物為:SEQID N0.7所示的核苷酸序列(5’ -CCTGACTAGTTCCTGCTAAG-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列(5，-TTAGGAAGCGTGCGGTGAAT-3，)；
(5)第5對上游引物為:SEQID N0.9所示的核苷酸序列(5’ -TCTGCCTTTATCTTCACATC-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.10 所示的核苷酸序列(5，-CCGGCCCTCTTAGCTTTAAC-3，)；
(6)第6對上游引物為:SEQID N0.11所示的核苷酸序列(5’ -TCGCCCTCCTTATCCAAATTTACC-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.12 所示的核苷酸序列(5’- AGGGGATCAAAACCGCATTCATAA_3，)；
(7)第7對上游引物為:SEQID N0.13所示的核苷酸序列(5’ -GCCTCTCTCCTTGCACAAGT-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.14 所示的核苷酸序列(5，-AAAAAGAGGGTGGCGGAAAG-3，)；
(8)第8對上游引物為:SEQID N0.15所示的核苷酸序列(5’ -GCCATCTCCCAATACCAAAC-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.16 所示的核苷酸序列(5’-TTGTTGTGAGGATCGCTACT-3’ )；
(9)第9對上游引物為:SEQID N0.17所示的核苷酸序列(5，-TAATTCTTGCTGCCGTCCTC-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.18 所示的核苷酸序列(5，-AGGCTGGTTAAGTCCGATAG-3，)；
(10)第10對上游引物為:SEQID N0.19所示的核苷酸序列(5，-TCAAAACAACGAGGCCTGAC-3’ )，下游引物為:SEQ ID N0.20 所示的核苷酸序列(5’-GGGTGCTCCCGGTTATGTAT-3’ )；
(11)第11對上游引物為:SEQID N0.21所示的核苷酸序列(5，-CTCCACATTCCTAGCCGTCTG-3’ )，下游引物為:SEQ ID N0.22 所示的核苷酸序列(5，-TTCAAGCCGTTAGTCCTGGTTAA -3’ )；
(12)第12對上游引物為:SEQID N0.23所示的核苷酸序列(5’ -GATCAACGAACCGAGTTACC-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.24 所示的核苷酸序列(5，-TAAGGAAGGCAACGGCTAGG-3，)；
(13)第13對上游引物為:SEQID N0.25所示的核苷酸序列(5，-CACCCTTCACAGTACTTGAG-3’ )，下游引物為:SEQ ID N0.26 所示的核苷酸序列(5，-GTCAATCATGAGAAGACTAT-3，)；
(14)第14對上游引物為:SEQID N0.27所示的核苷酸序列(5’ -TGAGGTTGAGCCGCCTGTAG-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.28 所示的核苷酸序列(5，-AGGGCAATGGGGGTGAAAAT-3，)；
(15)第15對上游引物為:SEQID N0.29所示的核苷酸序列(5’ -GGCACACGGTTATTGAAGGT-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.30 所示的核苷酸序列(5，-CAATCTGGCCAATAATAATG-3，)； (16)第16對上游引物為:SEQID N0.31所示的核苷酸序列(5’ -CCCAAGAAGTTTCATATCACCCC-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.32 所示的核苷酸序列(5’ -TCTATTTCCCGCTTACTGCTAAA -3’ )；
(17)第17對上游引物為:SEQID N0.33所示的核苷酸序列(5’ -CCCATGCTAGCCCTTACATT-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.34 所示的核苷酸序列(5’-ACGTGGTCTGTCTTGGTGTC-3’ )；
(18)第18對上游引物為:SEQID N0.35所示的核苷酸序列(5’ -AAATTATCTGGACTGTACTC-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.36 所示的核苷酸序列(5，-TGGGAATCAAGAATAAGTTT-3，)；
(19)第19對上游引物為:SEQID N0.37所示的核苷酸序列(5’ -CTGATGATACGGCCGAGCAG-3’)，下游引物為:SEQ ID N0.38 所示的核苷酸序列(5，-GAGTAGCCGGCGGTGATAAG-3，)；
(20)第20對上游引物為:SEQID N0.39所示的核苷酸序列(5，-GGAACAAGGAGCTGGTATCA-3’ )，下游引物為:SEQ ID N0.40 所示的核苷酸序列(5，-CCTACGAAGGCAGTCATCAT-3， )0
[0006]日本黃姑魚線粒體全基因組序列的擴增方法，以提取的日本黃姑魚基因組DNA為模板，首先用4對擴增引物進行4個大片段產(chǎn)物擴增，然后通過基因組步移的方法，使用剩余的16對擴增引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測后送生物公司測序。
[0007]作為優(yōu)選，4對擴增引物為第I對，第6對，第11對和第16對。
[0008]日本黃姑魚線粒體全基因組序列的擴增引物擴增獲得的日本黃姑魚線粒體全基因組序列，日本黃姑魚線粒體全基因組序列見SEQ ID N0.41所示的核苷酸序列。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:
1、本發(fā)明針對鱸形目石首魚科的日本黃姑魚設計了 20對特異性引物可以對日本黃姑魚
線粒體DNA進行PCR擴增，并獲得線粒體全長基因。
[0010]2、本發(fā)明首次獲得日本黃姑魚線粒體基因組全長序列，經(jīng)分析得出:序列全長16496 bp，包括13個蛋白質(zhì)編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因。
[0011]3、本發(fā)明的20對特異性引物可以對不同群體的日本黃姑魚基因組DNA進行PCR擴增。
[0012]4、獲得的日本黃姑魚線粒體全基因組序列，可為日本黃姑魚的保護遺傳學、進化遺傳學及優(yōu)良養(yǎng)殖品種的分子標記輔助選擇提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0013]下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。
[0014]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0015]
實施例:
以提取的日本黃姑魚基因組DNA為模板，首先用4對特異引物(第1，6，11和16對)進行4個大片段產(chǎn)物擴增，然后基因組步移的方法，使用本發(fā)明中的(2-5，7-10，12-15，17-20)引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測后送生物公司測序，對測序結(jié)果使用生物軟件對測序結(jié)果進行拼接，具體步驟如下:
U5XTBE Buffer 配制
稱量氨基丁三醇54g，Na2EDTA.2Η20 3.72g，硼酸27.5g于IL燒杯中；加入約800ml去離子水，攪拌均勻；用NaOH調(diào)pH至8.3，加去離子水定容至IL后，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0016]2、DNA 提取
采用高鹽法提取日本黃姑魚DNA，步驟如下:
(I)取日本黃姑魚(由浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗場提供)背部肌肉組織50mg放入裝有360 μ L 高鹽抽提緩沖液(0.4Μ NaCl, 1mM Tris-HCl pH8.0，2mM EDTA p