Gmfb的應(yīng)用、gmfb干擾劑及gmfb干擾劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞因子GMFB的用途，尤其是設(shè)及GMFB作為糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙?診斷生物標(biāo)記物的應(yīng)用并作為治療干預(yù)的祀點(diǎn)，GMFB干擾劑及GMFB干擾劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和老齡化進(jìn)程的加速，糖尿病（di油etesmille化s，DM) 的患病率正呈快速上升的趨勢(shì)，成為繼屯、腦血管疾病、腫瘤之后另一個(gè)嚴(yán)重危害人民健康 的重要慢性非傳染性疾病。世界衛(wèi)生組織推測(cè)，在2025年中國(guó)糖尿病患者將達(dá)到3億。糖 尿病視網(wǎng)膜病變值i油eticRetinopathy,DR)，簡(jiǎn)稱糖網(wǎng)病，是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥，在 DM患者中1/3發(fā)生DR，1/10發(fā)生致命性威脅視力的糖尿病黃斑水腫（di油eticmacular edema,DME)或者增殖性糖網(wǎng)?。╬roliferativedi油eticretinopathy,PDR)，嚴(yán)重影響患 者生活質(zhì)量，世界范圍內(nèi)DR已經(jīng)成為顯著的社會(huì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)問(wèn)題。DR曾被認(rèn)為是視網(wǎng)膜的 微血管病變，微循環(huán)損害是DR的經(jīng)典標(biāo)志，但是越來(lái)越多的證據(jù)提示在DR的病理過(guò)程中神 經(jīng)變性是一個(gè)早期事件，并參與微血管異常的發(fā)展。組織學(xué)上神經(jīng)元調(diào)亡和反應(yīng)性的膠質(zhì) 化是DR神經(jīng)變性的最重要的特征。目前DM捐獻(xiàn)眼在眼科檢查沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何微循環(huán)異常， 但是已經(jīng)具有主要的神經(jīng)變性的特點(diǎn)。視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞（RGC)是DR最先被檢測(cè)的發(fā)生調(diào)亡 的細(xì)胞；RGC丟失導(dǎo)致神經(jīng)纖維層變薄，在DM患者或者有輕微DR的DM患者通過(guò)OCT檢測(cè) 都檢測(cè)到，在沒(méi)有任何微血管病變的DMI型和II型病人發(fā)現(xiàn)ERG(electroretinogram，視 網(wǎng)膜電流圖）異常。神經(jīng)元調(diào)亡伴隨著Muller膠質(zhì)細(xì)胞的變化。目前尚不清楚神經(jīng)元調(diào) 亡和膠質(zhì)化哪一個(gè)在DR中是第一個(gè)發(fā)生的事件。研究DR神經(jīng)變性的機(jī)制及鑒定在神經(jīng)變 性的介導(dǎo)者對(duì)于研發(fā)新的治療策略是非常必要的。從臨床角度早期鑒別神經(jīng)變性對(duì)于基于 神經(jīng)保護(hù)的藥物的應(yīng)用是必須的。
[0003] DR神經(jīng)變性的機(jī)制研究現(xiàn)狀：介導(dǎo)DR神經(jīng)變性的主要機(jī)制有細(xì)胞外興奮毒性 谷氨酸（Glutamate,Glu)集聚、氧化應(yīng)激增加、視網(wǎng)膜分泌保護(hù)因子的減少及慢性炎癥。 SchellinSA等用光鏡和電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DM早期Muller細(xì)胞核已發(fā)生改變，而視網(wǎng)膜血管 內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞并未見(jiàn)明顯病理改變，DM早期視網(wǎng)膜Muller細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和生理功能 已發(fā)生變化，不僅影響早期DM患者神經(jīng)細(xì)胞功能異常（表現(xiàn)為視覺(jué)敏感度及色覺(jué)敏感度下 降，視網(wǎng)膜振蕩電位b波異常），而且影響整個(gè)DR的進(jìn)展過(guò)程。在研究介導(dǎo)DR神經(jīng)變性的 分子中，我們更關(guān)注Muller細(xì)胞產(chǎn)生的分子。
[0004]膠質(zhì)細(xì)胞成熟因子beta(gliamaturationfactorbeta,GMFB)與神經(jīng)變性：GMFB 最早從牛腦分離純化的17kd酸性胞漿蛋白，進(jìn)化上高度保守，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要由星形 膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)腦組織生長(zhǎng)、分化和再生有重要的作用，其表達(dá)在發(fā)育期上調(diào)，成年明顯 降低。在大鼠視網(wǎng)膜GMFB僅在Muller細(xì)胞表達(dá)，從胚胎14天到成年均表達(dá)。新近研究顯示 GMFB是一種促炎因子，與人中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病密切相關(guān)，如阿茨海默病和帕金森病。 GMFB基因敲除小鼠能夠抵抗實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎和MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2, 3, 6-四 氨化晚）的毒性。
[000引 目前用于DR進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞因子包括W下4類：（1)，調(diào)節(jié)自然免疫的因 子：比-化，比-10 ; (2)調(diào)節(jié)淋己細(xì)胞激活增殖和分化的因子：比-6和比-12 ; (3)與激活巨 隧細(xì)胞相關(guān)的因子：TNFa和TG訊(4)趨化因子，如MCP-1、SDF-I等，目前也未見(jiàn)GMFB在DR 中的作用報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種GMFB的應(yīng)用、 GMFB干擾劑及GMFB干擾劑的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的可W通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)GMFB是在大鼠視網(wǎng)膜的節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞層表 達(dá)，在STZ-誘導(dǎo)的糖尿病值M)的血糖升高的第一天在玻璃體可檢測(cè)到GMFB含量明顯升 高，持續(xù)到第四周，然后逐漸下降，可作為生物標(biāo)記物檢測(cè)DR發(fā)病的過(guò)程。GMFB處理大鼠 MulIer細(xì)胞（視網(wǎng)膜的膠質(zhì)細(xì)胞）引起谷氨酷胺合成酶含量降低，導(dǎo)致MulIer細(xì)胞功能受 損；用GMFB處理光感受器細(xì)胞系661W引起自隧；在正常SD大鼠視網(wǎng)膜下腔注射3*10~6gc AAV2/8-GMFB病毒，在注射后6周，出現(xiàn)ERG波幅下降，視網(wǎng)膜核層變薄，光感受器細(xì)胞丟失， 節(jié)細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡。運(yùn)一發(fā)現(xiàn)首次證實(shí)GMFB在DR早期明顯上調(diào)，介導(dǎo)神經(jīng)視網(wǎng)膜變性，在 STZ-誘導(dǎo)的DR第一天，ERG檢測(cè)即可發(fā)現(xiàn)b波波幅下降，提示視功能損害，可能與高血糖引 起的氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)視網(wǎng)膜的損害有關(guān)。進(jìn)行視網(wǎng)膜下腔注射3*10~6gc AAV2/8-shGMFB 4 周后檢測(cè)，對(duì)注射空病毒組相比，ERG檢測(cè)B波增高，提示視功能受到保護(hù)。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供了GMFB作為糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙谠\斷W及病程進(jìn)展 的生物標(biāo)記物的應(yīng)用。
[0010] 所述的生物標(biāo)記物是指檢測(cè)玻璃體GMFB的含量評(píng)估DR的病程進(jìn)展。
[0011] 本發(fā)明的第二方面，提供了GMFB作為糖尿病視網(wǎng)膜病變治療祀點(diǎn)的應(yīng)用，并提供 了GMFB介導(dǎo)視網(wǎng)膜變性的可能機(jī)制，可W通過(guò)干擾技術(shù)下調(diào)DR大鼠視網(wǎng)膜GMFB蛋白的表 達(dá)，從而保護(hù)視功能。
[0012] 本發(fā)明的第=方面，提供了GMFB干擾劑，所述的GMFB干擾劑為干擾GMFB活性或 下調(diào)GMFB表達(dá)的物質(zhì)，所述的GMFB干擾劑為化學(xué)合成的shGMFB，或包含ShGMFB的載體，其 中，ShGMFB為小發(fā)卡GMFB寡核巧酸（smallhai巧inGMFB，shGMFB)。
[0013] 本發(fā)明的第四方面，提供了GMFB干擾劑的應(yīng)用，GMFB干擾劑用于制備預(yù)防、改善 或治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的藥物組合物。
[0014] 本發(fā)明利用ELISA方法檢測(cè)STZ-誘導(dǎo)DM大鼠玻璃體GMFB的含量，發(fā)現(xiàn)GMFB在 實(shí)驗(yàn)性DM大鼠的早期顯著升高維持在高水平至發(fā)病后4周，然后逐漸下降。然后發(fā)現(xiàn)，在 STZ-誘導(dǎo)的I型糖尿病燈IDM)大鼠中，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)GMFB表達(dá)能夠抑制膠質(zhì)化， 明顯下調(diào)GFAP的表達(dá)（膠質(zhì)化的標(biāo)記物），降低炎癥因子分泌，保護(hù)視功能。而AAV2/8介 導(dǎo)的GMFB過(guò)表達(dá)又能夠引起節(jié)細(xì)胞調(diào)亡，損害視功能，最后體外實(shí)驗(yàn)采用GMFB處理MulIer 細(xì)胞引起Muller細(xì)胞轉(zhuǎn)化谷氨酸毒性能力下降，與谷氨酷胺合酶下降有關(guān)；用GMFB處理 661W細(xì)胞，引起光感受器細(xì)胞自隧性死亡。運(yùn)說(shuō)明GMFB可作為DR發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)生物標(biāo) 記物，同時(shí)GMFB也可作為DR早期干預(yù)的祀向，而保護(hù)視功能。
[0015] 本發(fā)明首次證實(shí)在STZ-誘導(dǎo)的I型糖尿病燈IDM)大鼠中，在發(fā)病早期GMFB在玻 璃體含量顯著升高。首次證實(shí)隨著DR的病情進(jìn)展，GMFB含量逐漸下降，可W用動(dòng)態(tài)檢測(cè)DR進(jìn)展；首次證實(shí)干擾DR大鼠GMFB表達(dá)，可W保護(hù)視功能。首次證實(shí)GMFB介導(dǎo)視網(wǎng)膜變性 的機(jī)制，包括引起Muller細(xì)胞的谷氨酷胺合酶降低，導(dǎo)致節(jié)細(xì)胞死亡，并誘導(dǎo)光感受器細(xì) 胞引起自隧。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)： 陽(yáng)017] 1)在DR大鼠的視網(wǎng)膜，發(fā)現(xiàn)GMFB在節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層、RPE層均表達(dá)，在DR極早 期（血糖升高的第一天）在玻璃體GMFB含量顯著升高； 陽(yáng)01引2)在正常SD大鼠過(guò)表達(dá)GMFB引起視網(wǎng)膜變性。首次證實(shí)了GMFB介導(dǎo)神經(jīng)變性的 機(jī)制，包括引起Muller細(xì)胞谷氨酷胺合酶降低，節(jié)細(xì)胞調(diào)亡和光感受器細(xì)胞自隧性死亡；
[0019] 如在DR視網(wǎng)膜干擾GMFB，膠質(zhì)化過(guò)程受到抑制，保護(hù)視功能。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1 :GMFB在DR發(fā)病不同核層的表達(dá)結(jié)果； 陽(yáng)02U 圖2:在STZ-誘導(dǎo)的TIDM大鼠的玻璃體中GMFB濃度隨著DR病程的變化結(jié)果； 陽(yáng)02引圖3 :AAV2/8-shGMFB干擾對(duì)STZ-誘導(dǎo)DR的視功能影響結(jié)果； 陽(yáng)02引圖3a:ShGMFB視網(wǎng)膜下腔注射DR大鼠，GMFB與GFAP變化結(jié)果；
[0024]圖3b =ShGMFB視網(wǎng)膜下腔注射DR大鼠，在注射后第四、六周邸G檢測(cè)b波結(jié)果；陽(yáng)0巧]圖3c : ShGMFB視網(wǎng)膜下腔注射DR大鼠，在注射后第四周mRNA水平檢測(cè)GFAP、GMFB 表達(dá)結(jié)果； W26]圖4 :GMFB過(guò)表達(dá)結(jié)果；
[0027] 圖4a:AAV2/8-GMFB視網(wǎng)膜下腔注射后6周后外殼層變化情況；
[0028] 圖4b:AAV2/8-GMFB視網(wǎng)膜下腔注射后6周后節(jié)細(xì)胞調(diào)亡情況；
[0029] 圖5 :GMFB處理Muller對(duì)谷氨酷胺合酶的影響；
[0030] 圖6 :GMFB處理661w引起自隧結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0032] W下實(shí)施例中，661W購(gòu)自ATCC，培養(yǎng)基為低糖DMEM。rMC-1細(xì)胞系由實(shí)驗(yàn)室制備， 培養(yǎng)基為高糖0161，含10%血清和1%?/5。培養(yǎng)環(huán)境是37°(：、5%〇)2和95%空氣。^ AAV2/8作為載體介導(dǎo)GMFB的過(guò)表達(dá)，記做載體AAV2/8-GMFB ; W AAV2/8作為載體介導(dǎo)GMFB 的干擾載體記為AAV2/8-shGMFB。AAV2/8-shGMFB和AAV2/8-GMFB為商品化包裝好的病 毒，購(gòu)自武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司，滴度l〇~9gc/ml，LC3病毒購(gòu)自漢恒生物，大鼠GMFB ELISA試劑盒購(gòu)自el油science。 陽(yáng)〇3引 實(shí)施例1
[0034] GMFB在糖尿病視網(wǎng)膜不同核層的表達(dá)
[0035] 1、糖尿病大鼠制備：采用雄性SD大鼠，160-180g，實(shí)驗(yàn)前先將大鼠饑餓24小時(shí)。 單次腹腔內(nèi)注射STZ(60mg/kg體重）來(lái)誘發(fā)DM，正常對(duì)照組腹腔注射等體積的巧樣酸溶液； 24小時(shí)后斷尾取血測(cè)血糖，血糖值低于250mg/化的大鼠補(bǔ)充注射STZ。連續(xù)3天測(cè)血糖。 將血糖連續(xù)3天超過(guò)250mg/化的大鼠確定為DM大鼠（血糖低于250