同時(shí)檢測(cè)空腸彎曲菌三種血清型的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及PCR檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是設(shè)及用于檢測(cè)空腸彎曲菌血清型服:41、 HS: 19、服:2的特異性引物對(duì)組合和S重PCR檢測(cè)方法，本發(fā)明還設(shè)及同時(shí)檢測(cè)空腸彎曲菌 =種血清型的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 空腸彎曲菌（Camp^obacterjejuni)是彎曲菌屬中主要導(dǎo)致人類(lèi)疾病的食源性 病原菌，是導(dǎo)致人類(lèi)腹瀉的主要病原之一?？漳c彎曲菌分布廣泛，人類(lèi)感染主要是由于空腸 彎曲菌污染食品、飲用水W及環(huán)境引起的，除腸炎外，空腸彎曲菌的感染可導(dǎo)致格林-己利 綜合癥（Guillian-Barresyn化ome，簡(jiǎn)稱(chēng)GB巧，給人類(lèi)帶來(lái)嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。國(guó)內(nèi)外對(duì)空 腸彎曲菌的監(jiān)測(cè)都非常關(guān)注。
[0003] 空腸彎曲菌感染后導(dǎo)致GBS的機(jī)率不大，但特異菌型菌株，如血清型（Penner heat-st油Ieserotype,服）為服:41，服：19,服:2的菌株感染后導(dǎo)致GBS的危險(xiǎn)度大大增 高。血清型為服:41菌株的感染，曾經(jīng)導(dǎo)致我國(guó)36人GBS的暴發(fā)。對(duì)于運(yùn)種感染后可導(dǎo)致 嚴(yán)重疾病后果的空腸彎曲菌血清型的鑒別確定有利于疾病防控和保障公共衛(wèi)生安全。
[0004] 目前空腸彎曲菌的血清型鑒定試劑匿乏、昂貴，實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，需要有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè) 人員操作，造成空腸彎曲菌血清分型的困難。因此迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏地檢 測(cè)空腸彎曲菌血清型服:41，服：19,服：2的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供用于同時(shí)檢測(cè)空腸彎曲菌（Camp^obacterjejuni)S種 血清型服:41，服：19,服：2的特異性引物對(duì)組合。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供能夠同時(shí)檢測(cè)空腸彎曲菌服:41，服：19,服：2血清 型的試劑盒。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過(guò)對(duì)決定菌株血清型的芙膜多糖（polysaccharide capsule,簡(jiǎn)稱(chēng)CP巧合成相關(guān)基因簇的特異核巧酸序列的檢測(cè)確定彎曲菌的血清型特征。 對(duì)服:41，服：19,服：2S種血清型空腸彎曲菌分別找出其共同的CPS合成基因簇相關(guān)DNA 序列，W及區(qū)別于其它血清型的特異DNA序列，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定篩選出運(yùn)些 序列針對(duì)上述S種血清型菌株的共同性W及特異性。通過(guò)比對(duì)，獲得服:41，服：19,服：2S 種血清型菌株共有而其它血清型菌株中不存在的=段特異序列：服:41血清型菌株特異性 序列命名為SE-服41-3,服：19血清型菌株特異序列命名為SE-服19-1，服：2血清型菌株特 異序列命名為SE-HS2-4,具體核巧酸序列分別如SEQIDNO. 7-9所示。
[0008]VectorNTISuite6比對(duì)已測(cè)序服：41，服：19,服：2的(PS相關(guān)基因的特異序列 一的保守性。并用primerpremier5設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)避開(kāi)序列的突變點(diǎn)，同時(shí)要考慮 所設(shè)計(jì)的=對(duì)引物之間W及引物與祀序列之間不錯(cuò)配，不出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且=對(duì)引物擴(kuò) 增的目的片段的長(zhǎng)度具有區(qū)別度，大小不能太接近。
[0009] 經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證對(duì)比，最終確定用于檢測(cè)空腸彎曲菌=種血清型的特異性引物對(duì)組 合，分別為：
[0010] 用于檢測(cè)血清型服:41的特異性引物對(duì)，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQID NO. 1、2 所示；
[0011] 用于檢測(cè)血清型服:19的特異性引物對(duì)，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQID NO. 3、4 所示；
[0012] 用于檢測(cè)血清型服:2的特異性引物對(duì)，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQID NO. 5、6 所示。
[001引進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 1-2所示的引物對(duì)在制備檢測(cè) 空腸彎曲菌血清型HS: 41試劑盒或診斷試劑中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 3-4所示的引物對(duì)在制備檢測(cè)空腸彎曲菌 血清型服：19試劑盒或診斷試劑中的應(yīng)用。
[001引本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 5-6所示的引物對(duì)在制備檢測(cè)空腸彎曲菌 血清型服:2試劑盒或診斷試劑中的應(yīng)用。
[0016] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用序列如SEQIDNO. 1-2所示的引物對(duì)空腸彎曲菌血清 型服:41 采用PCR方法檢測(cè)，反應(yīng)條件為：94°CSmin;94°C30s，55°C30s，72°CImin,共 30 個(gè)循環(huán)；72°ClOmin，將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，若目的條帶為328bp，則說(shuō)明待測(cè)菌為 空腸彎曲菌血清型服:41。
[0017] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用序列如SEQIDNO. 3-4所示的引物對(duì)空腸彎曲菌血清 型服：19 采用PCR方法檢測(cè)，反應(yīng)條件為：94°C5min;94°C30s，55°C30s，72°CImin,共 30 個(gè)循環(huán)；72°ClOmin，將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，若目的條帶為649bp，則說(shuō)明待測(cè)菌為 空腸彎曲菌血清型服：19。
[0018] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用序列如SEQIDNO. 5-6所示的引物對(duì)空腸彎曲菌血清 型服:2采用PCR方法檢測(cè)，反應(yīng)條件為：94°C5min;94°C30s，55°C30s，72°CImin,共30個(gè) 循環(huán)；72°ClOmin，將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，若目的條帶為78化p，則說(shuō)明待測(cè)菌為空 腸彎曲菌血清型服:2。
[0019] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 7所述的祀序列在檢測(cè)空腸彎 曲菌血清型服:41中的用途W(wǎng)及該祀序列在制備檢測(cè)空腸彎曲菌血清型服:41的試劑盒或 試劑中的用途。
[0020]SEQIDNO. 7編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 10所示。
[002。 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 8所述的祀序列在檢測(cè)空腸彎 曲菌血清型服：19中的用途W(wǎng)及該祀序列在制備檢測(cè)空腸彎曲菌血清型服：19的試劑盒或 試劑中的用途。
[002引SEQIDNO. 7編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 11所示。
[002引進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了核巧酸序列如SEQIDNO. 9所述的祀序列在檢測(cè)空腸彎 曲菌血清型服:2中的用途W(wǎng)及該祀序列在制備檢測(cè)空腸彎曲菌血清型服:2的試劑盒或試 劑中的用途。
[0024]SEQIDNO. 7編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 12所示。
[00巧]本發(fā)明提供了含有上述3對(duì)特異性引物對(duì)的組合在制備檢測(cè)空腸彎曲菌血清型 試劑盒中的應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明提供了含有上述特異性引物對(duì)組合的試劑盒。
[0027] 本發(fā)明的試劑盒是W上述針對(duì)3種血清型的特異性引物對(duì)組合為引物，W待測(cè) 菌DNA為模板，進(jìn)行PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若電泳結(jié)果顯示目的條帶為 328bp，則待測(cè)菌為空腸彎曲菌血清型服:41;若電泳結(jié)果顯示目的條帶為649bp，則待測(cè)菌 為空腸彎曲菌血清型服：19 ;若電泳結(jié)果顯示目的條帶為78化P，則待測(cè)菌為空腸彎曲菌血 清型服:2。
[002引優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒的25y1PCR反應(yīng)體系為，EasySuperMix12. 5y1，d地20 8. 5y1，3對(duì)特異性引物對(duì)的上、下游引物均為0. 5y1，濃度均為10yM，DNA模板1y1。
[0029] 優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒的PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0030] 94°C預(yù)變性5min;
[0031]94°C變性Imin，60°C退火Imin，72°CImin，30 個(gè)循環(huán)；
[0032] 72°C7min;4°C保持。
[0033] 本發(fā)明提供了一種非診斷目的的檢測(cè)空腸彎曲菌S種血清型的方法，所述S種血 清型為服:41、服：19和服:2,同時(shí)使用3對(duì)特異性引物，通過(guò)一次PCR反應(yīng)，對(duì)待測(cè)菌DNA 進(jìn)行檢測(cè)，若將擴(kuò)增產(chǎn)物大小為328bp，則待測(cè)菌為空腸彎曲菌血清型服:41;若擴(kuò)增產(chǎn)物 大小為649bp，則待測(cè)菌為空腸彎曲菌血清型服：19 ;若擴(kuò)增產(chǎn)物大小為78化P，則待測(cè)菌為 空腸彎曲菌血清型服:2;
[0034] 所述3對(duì)特異性引物分別為：
[0035] 用于檢測(cè)血清型服:41的特異性引物對(duì)，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQ ID NO. 1、2所示；
[0036] 用于檢測(cè)血清型服:19的特異性引物對(duì)，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQID NO. 3、4 所示；
[0037] 用于檢測(cè)血清型服:2的特異性引物對(duì)，其上、下游引物核巧酸序列分別如SEQID NO. 5、6 所示。
[0038] 本法提供的非診斷目的的檢測(cè)空腸彎曲菌S種血清型的方法中PCR反應(yīng)的反應(yīng) 程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min;
[0039] 94°C變性Imin，60°C退火Imin，72°CImin，30 個(gè)循環(huán)；
[0040] 72°C7min;4°C保持。
[0041] 本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)空腸彎曲菌=種血清型的特異性祀序列組合，分別是： 檢測(cè)血清型服:41的特異性祀序列，其核巧酸序列如SEQIDNO. 7所示；檢測(cè)血清型服：19 的特異性祀序列，其核巧酸序列如SEQIDNO. 8所示；檢測(cè)血清型服:2的特異性祀序