一種油茶良種的分子特異性標(biāo)記引物及鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種油茶良種的分子特異性標(biāo)記引物及鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]油茶是我國栽植面積最大、分布范圍較廣的木本油料樹種。大力發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)，對保障糧油安全，促進(jìn)農(nóng)民增收，推進(jìn)山區(qū)綜合開發(fā)和建設(shè)社會主義新農(nóng)村，都具有十分重要的意義。我國油茶產(chǎn)業(yè)方興未艾，發(fā)展?jié)摿薮?。目前，我國油茶林總面積達(dá)4500多萬畝，但產(chǎn)量很低，每畝產(chǎn)茶油僅4公斤左右。其根本原因是，絕大部分油茶林品種品質(zhì)差或嚴(yán)重退化，而大量的國家和省級審(認(rèn))定的優(yōu)良品種又未推廣應(yīng)用。同時，一些地方種苗質(zhì)量意識淡薄，經(jīng)營管理粗放。為保障油茶產(chǎn)業(yè)又好又快發(fā)展，要充分認(rèn)識油茶良種對發(fā)展油茶產(chǎn)業(yè)的重要性，必須加快油茶優(yōu)良種苗發(fā)展和強(qiáng)化質(zhì)量管理。
[0003]我國目前對油茶種苗質(zhì)量的監(jiān)督管理，主要依靠在管理層面制定的各項制度，而在技術(shù)層面尚未取得關(guān)鍵性突破，特別是缺乏油茶良種的早期快速鑒別技術(shù)體系。目前通過國家林木良種審定的12個長林品種系列分別為長林3號、長林4號、長林18號、長林21號、長林23號、長林26號、長林27號、長林40號、長林53號、長林55號、長林56號、長林166號。這些油茶良種具有早實豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、出籽率高、含油量高、抗性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點。對油茶種苗質(zhì)量的監(jiān)督管理要著力解決目前生產(chǎn)上油茶種苗的混亂局面，并首先從技術(shù)層面上對長林油茶良種進(jìn)行鑒別保護(hù)。
[0004]目前對油茶品種的鑒別主要依據(jù)表觀特征，但由于許多形態(tài)性狀鑒定的周期長、受環(huán)境影響大，并且品種數(shù)量不斷增多，使得品種鑒定愈來愈困難。自本世紀(jì)以來，一些基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、ISSR (Inter-Simple Sequence Repea，簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性)和SRAP(sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性)相繼用于了油茶的種質(zhì)資源遺傳多樣性、遺傳距離研究，但對于分子標(biāo)記與油茶性狀的連鎖、油茶品種間的分子鑒別研究很少。況且，這些分子標(biāo)記技術(shù)所采用的均為通用引物，其PCR擴(kuò)增圖譜不僅復(fù)雜、重復(fù)性差，而且特異性不高，因此并不適合用于品種鑒別，只有開發(fā)出某個品種穩(wěn)定、特異的DNA指紋標(biāo)記才能真正用于該品種的準(zhǔn)確快速鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種油茶良種長林21號的分子特異性標(biāo)記引物，可對油茶良種長林21號進(jìn)行快速的早期鑒別。
[0006]本發(fā)明還提供了一種能對油茶良種長林21號進(jìn)行快速鑒定的方法，方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分子手段。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種油茶良種的分子特異性標(biāo)記引物，所述分子特異性標(biāo)記引物的序列如下: 上游引物:5' -CGGACTGATTATCCTTGGCAAT-3' (SEQ ID N0.1),
下游引物:5' -AGATCCCGCCCAAGACCTT-3r (SEQ ID N0.2)。
[0008]本發(fā)明的分子特異性標(biāo)記引物(引物對)是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過大量篩選試驗獲得油茶良種長林21號的特異性DNA片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎(chǔ)設(shè)計特異性引物，以該引物對油茶良種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅長林21號可穩(wěn)定獲得571 bp大小的特異性片段，而其他油茶品種均不能獲得該特異性片段。需要說明的是，本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物僅限于油茶良種的鑒別(鑒別其是否為長林21號)，即待測樣品僅限于油茶。
[0009]作為優(yōu)選，所述分子特異性標(biāo)記引物應(yīng)用于油茶良種長林21號的鑒定。
[0010]一種油茶良種的鑒定方法，所述鑒定方法為:提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)571 bp大小的DNA條帶，則待測油茶品種為油茶良種長林21號，反之則否。
[0011]本發(fā)明方法關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物的選擇，DNA提取、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件確定，以及電泳檢測，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。
[0012]鑒定方法具體如下:
(1)取待測油茶幼嫩葉片，加液氮磨碎，利用新型快速植物基因組DNA提取盒(DP3111，B1Teke，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取油茶的基因組DNA ;
(2)以步驟(I)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增:
PCR反應(yīng)體系每20 μ L組成如下:
2X Power Taq PCR Master Mix 10 μ L10 μ M上、下游引物各I μ L
20 ng/μ L 模板 DNA3 yL
ddH205 μ L
PCR反應(yīng)條件如下:
94°C預(yù)變性 7 min;94°C變性 45 min，66.5°C退火 45 s，72°C延伸 2 min，共 30 個循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7 min，終止溫度為4°C。
[0013]取步驟(2)擴(kuò)增產(chǎn)物5 μ L，與I μ L 0.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于I X TAB緩沖液中、5 V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動凝膠圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)571 bp的DNA條帶，則待測油茶品種為長林21號，反之則否。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物可對油茶良種長林21號進(jìn)行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分子手段。
【附圖說明】
[0015]圖1是本發(fā)明對油茶良種進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；M*DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；編號4為油茶良種長林21號，擴(kuò)增出了分子量為571 bp的特異DNA條帶；其余編號為其它的長林油茶良種，未見有500 bp多大小的特異DNA條帶產(chǎn)生。
【具體實施方式】
[0016]下面通過具體實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0017]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0018]實施例:
Cl)油茶良種基因組DNA的提取:
取待測油茶良種幼嫩葉片0.03 g，加液氮徹底磨碎，基因組DNA的提取利用新型快速植物基因組DNA提取盒(DP3111，B1Teke，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)，以提取獲得油茶良種的基因組DNA粗提物。DNA粗提物通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和DNA/RNA紫外分光光度計(Nanodrop Technologies, USA)來檢測完整性、純度及濃度。0D26Q/0D2SQ>1.8 的 DNA樣品用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。DNA提取物于_20°C冰箱貯藏備用。
[0019](2)設(shè)計特異PCR擴(kuò)增引物，引物對的序列為:
上游引物:5 ' -CGGACTGATTATCCTTGGCAAT-3 ' (SEQ ID N0.1)和下游引物:5 '-AGATCCCGCCCAAGACCTT-3' (SEQ ID N0.2)，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。
[0020](3) PCR 擴(kuò)增:
PCR反應(yīng)液組成:PCR反應(yīng)體系每20 μ L組成如下:
2X Power Taq PCR Master Mix 10 μ L(PR1700，B1Teke，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)
10 μ M上、下游引物各I μ L
20 ng/μ L 模板 DNA3 yL
ddH205 μ L0
[0021]擴(kuò)增反應(yīng)在Life ECO型擴(kuò)增儀(B1er，杭州博日科技有限公司)上進(jìn)行。擴(kuò)增條件:94°C預(yù)變性7 min;94°C變性45 min，66.5°C退火45 s，72°C延伸2 min，共30個循環(huán)；最后于72°C補(bǔ)平7 min，終止溫度為4°C。
[0022](4)電泳檢測:取步驟(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 yL，與I yL 0.25%溴酚蘭緩沖液(0.25g溴酚蘭溶解于100 ml 40% (ff/V)的蔗糖水溶液中)混勻，點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于I X TAE緩沖液中，5 V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，在含0.5 μ g/mL EB的水溶液中染色30分鐘，然后在美國伯樂自動凝膠圖像分析儀(Chemi Doc XRS imaging system, B1-Rad,Hercules, CA, USA)上照相。
[0023]按照上述方法，分別對多個油茶良種(編號1~12代表油茶良種依次為:1:長林3號、2:長林4號、3:長林18號、4:長林21號、5:長林23號、6:長林26號、7:長林27號、8:長林40號、9:長林53號、10:長林55號、11:長林56號、12:長林166號)的特異引物PCR擴(kuò)增圖譜進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果見圖1。
[0024]油茶良種均來自浙江省金華市武義縣。
[0025]箭頭所指為僅從編號為4的油茶良種長林21號中擴(kuò)增出了一條清晰明亮、穩(wěn)定的分子量約為500 bp多大小的特異DNA條帶，而其余編號的長林油茶良種，未見有500 bp多大小的特殊DNA條帶產(chǎn)生，也未有其它非目的條帶產(chǎn)生，可見本發(fā)明開發(fā)出的分子特異性標(biāo)記用于油茶良種長林21號的鑒別，其穩(wěn)定性、特異性非常高。
[0026]以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
【主權(quán)項】
1.一種油茶良種的分子特異性標(biāo)記引物，其特征在于:所述分子特異性標(biāo)記引物的序列如下: 上游引物:5' -CGGACTGATTATCCTTGGCAAT-3'， 下游引物:5' -AGATCCCGCCCAAGACCTT-3'。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子特異性標(biāo)記引物，其特征在于:所述分子特異性標(biāo)記引物應(yīng)用于油茶良種長林21號的鑒定。3.—種油茶良種的鑒定方法，其特征在于，所述鑒定方法為:提取待測油茶品種葉片的基因組DNA作為模板，以分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)571 bp大小的DNA條帶，則待測油茶品種為油茶良種長林21號，反之則否。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒定方法，其特征在于，所述分子特異性標(biāo)記引物的序列如下: 上游引物:5' -CGGACTGATTATCCTTGGCAAT-3'， 下游引物:5' -AGATCCCGCCCAAGACCTT-3'。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種油茶良種的分子特異性標(biāo)記引物及鑒定方法，所述分子特異性標(biāo)記引物的序列如下：上游引物：5′-CGGACTGATTATCCTTGGCAAT-3′，下游引物：5′-AGATCCCGCCCAAGACCTT-3′。本發(fā)明分子特異性標(biāo)記引物可對油茶良種長林21號進(jìn)行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準(zhǔn)確，是表觀特征辨別油茶良種所不能替代的分子手段。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105154529
【申請?zhí)枴緾N201510436641
【發(fā)明人】沈愛華, 袁位高, 吳初平, 江波, 李婷婷, 李海波
【申請人】浙江省林業(yè)科學(xué)研究院
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年7月23日