一種大菱鲆弧菌和魚腸道弧菌的雙重lamp檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及大菱解弧菌和魚腸道弧菌的檢測方法，具體設(shè)及大菱解弧菌和魚腸道 弧菌的雙重LAMP檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大菱解弧菌（Vibrioscophthalmi)是一種革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，現(xiàn)已知 該菌是大菱解、牙解等重要經(jīng)濟(jì)魚類的致病菌，病魚癥狀為皮膚變黑、肝臟和小腸出 血、并伴有腹水和腹脹；魚腸道弧菌（Vibrioichthyoenteri)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中新發(fā)現(xiàn)的 一種革蘭氏陰性致病菌，呈桿狀，兩端純圓，散在或成雙，無芽抱，可感染大菱解 (Scophthalmusmaximus)、牙魚平（Paralichthysolivaceus)、石魚棠化areiusbicoloratus) 等多種名貴海水養(yǎng)殖魚類，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 目前，針對大菱解弧菌和魚腸道弧菌的檢測技術(shù)主要是PCR法、DNA雜交法和菌落 雜交法。然而，由于運(yùn)些方法通常需要昂貴的儀器設(shè)備，且操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，很難推廣應(yīng) 用。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是 2000年由 Notomi等人發(fā)明的一種新的病原核酸檢測技術(shù)，該技術(shù)根據(jù)祀序列設(shè)計(jì)四條特異性引物， 可W特異性識別祀序列的六個(gè)特定區(qū)域，在等溫條件下，通過BstDNA聚合酶的鏈置換和鏈 延伸作用，可W在1小時(shí)內(nèi)對祀序列實(shí)現(xiàn)109倍的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物加入巧光染料SYBRGreen I后，陽性結(jié)果變?yōu)榫G色，陰性無變化，可W通過肉眼直接觀察，實(shí)現(xiàn)了大菱解弧菌和魚腸道 弧菌的快速檢測，且操作簡便，特異性好，適合基層養(yǎng)殖場對病原的快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種大菱解弧菌和魚腸道弧菌的雙重LAMP的檢測方法，目的是實(shí) 現(xiàn)對大菱解弧菌和魚腸道弧菌進(jìn)行特異、靈敏、快速、簡便的現(xiàn)場檢測。改善原有檢測技術(shù) 繁瑣、費(fèi)時(shí)的弊端。 陽0化]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)： 1、 提供2組LAMP引物序列，大菱解弧菌長度分別為49bp，43bp，18bp，2化P的核巧酸 序列，分別命名為luxR-FIP、luxR-BIP、1UXR-F3、1UXR-B3,魚腸道弧菌長度分別為46bp， 46bp，18bp，19bp的核巧酸序列，分別命名為ToxR-FIP、ToxR-BIP、ToxR-F3、ToxR-B3 ; 2、 配置LAMP反應(yīng)體系，通過LAMP反應(yīng)程序?qū)悠纺０暹M(jìn)行擴(kuò)增，確定最佳反應(yīng)體系和 反應(yīng)條件； 3、 反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定：2%瓊脂糖凝膠電泳；產(chǎn)物加入SYBRGreenI，觀察反應(yīng)管中顏色 變化。
[0006] 具體包括如下步驟： 1、設(shè)計(jì)LAMP引物：根據(jù)GeneBank中已知V.scophthalmi的luxR(GenBank:JN684209. 1)和V.ichthyoenteri的ToxR基因（GenBank:KT265743)作為祀 序列，通過PrimerExploreV4在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)四條特異性引物，對于V.scophthalmi, 在FIP的Flc和F2之間添加EcorI酶切位點(diǎn)，在BIP的Blc和B2之間添加-TTTT-連接 子；對于V.ichthyoenteri，在FIP的Flc和F2之間在BIP的Blc和B2之間添加EcorV酶 切位點(diǎn)，在BIP的Blc和B2之間添加-TTTT-連接子。設(shè)計(jì)W下兩組引物： !UXR-F3F3 AGCAAAAAGACCCCGCAC !uxR-B3BjCGGTTTCGTTCTCGGTGTT IuxR-FIP「iCGGCGCGCAAATACATCCAGAGAA-GAATTC- F2GACTCTCGCCCAAAAAACGT(Ecorl) IuxR-BlPBk' GTGGGATTGGTCGTGGTGGT-TTTT- B2 ATACCGTGGCGACCGATAC ToxR-FjF3 TTTGCCGCTCAGCTAACC ToxR-B3 B3 廣CCAACCCCAAGTTGAGTT ToxR-FIPFlcAAGCGTAACCATGCCGCCAC-GATATC- F2TACGCGTGGTGTCTATAGCA(EcorV) Tox技-B巧 控IeAGTTCAGCCATGAAGTTGGGCA-TTrT- B2 TGOTTTATGAATTGCCCCCT 2、配制LAMP反應(yīng)體系 反應(yīng)體系的終濃度為：總體系25y1，包括BstDNA聚合酶1y1 (8000U/ml)， 10XBstDNABuffer2. 5y1，PCR級甜菜堿 4yU5M)，dNTPs(2. 5mMeach) 2. 5y1，DNA模版 1y1，F(xiàn)IP/BIP各1y1 (0. 8yM)，F(xiàn)3/B3各1y1 (0. 2yM)，加滅菌雙蒸水使反應(yīng)體系總體積 達(dá)到25Ji1。
[0007] 3、LAMP反應(yīng)體系擴(kuò)增：將上述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)溫度58到65°C，反應(yīng) 時(shí)間為15到90min.。
[0008] 4、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：2%瓊脂糖凝膠電泳；產(chǎn)物加入SYBRGreenI，觀察反應(yīng)管中顏 色變化。
[0009] 本發(fā)明提供的大菱解弧菌和魚腸道弧菌雙重LAMP檢測方法，有W下優(yōu)勢： 一、靈敏度高對大菱解弧菌和魚腸道弧菌的檢測可低至12C即/ml,比普通PCR高100 倍。
[0010] 二、特異性強(qiáng)所需的特異性引物分別根據(jù)大菱解弧菌的IuxR基因和魚腸道弧菌 的ToxR基因六個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，特異性比常規(guī)PCR強(qiáng)。
[0011]S、檢測時(shí)間段比左右即可獲得檢測結(jié)果，比普通PCR省時(shí)。
[0012] 四、儀器設(shè)備要求低不需要PCR儀等昂貴儀器，產(chǎn)物可W進(jìn)行電泳，也可W直接 加入SYBRGreenI染料，觀察顏色變化，從而確定反應(yīng)與否。
[0013] 五、操作簡單、結(jié)果易觀察：整個(gè)檢測過程不設(shè)及復(fù)雜儀器設(shè)備，產(chǎn)物加入 SYBRGreenI染料，可W直接用肉眼觀察判斷。
[0014] 綜上所述，本發(fā)明具有比現(xiàn)有的PCR技術(shù)檢測大菱解弧菌和魚腸道弧菌的方法， 有更高的特異性、靈敏度和便捷性，并且可W在實(shí)際生產(chǎn)中用于現(xiàn)場檢測，有利于及時(shí)發(fā)現(xiàn) 魚類養(yǎng)殖中的大菱解弧菌和魚腸道弧菌的感染。
【附圖說明】
[0015] 圖1雙重LAMP反應(yīng)體系溫度的優(yōu)化（A:V.SCO地thalmi巧：V.ichthyoenteri) 反應(yīng)溫度溫度梯度從左往右依次58°C到65°C8個(gè)梯度1，3, 5, 7,9,11，13,15分別為 58°C，59 °C，60 °C，ere，62 °C，63 °C，64°C，65°C的陰性對照；2,4,6,8,10,12,14,16 分別為 58°(：，59°(：，60°(：，61°(：，62°(：，63°(：，64°(：，65°(：加模版。]?:111曰'1?5'。。
[0016] 圖2雙重LAMP反應(yīng)體系時(shí)間的優(yōu)化（A:V.SCO地thalmi巧：V.ichthyoenteri) 反應(yīng)時(shí)間 1-6 分別代表 15min, 30min, 45min, 60min, 75min, 90min;M為marker。
[0017] 圖3雙重LAMP反應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳圖譜及酶切分析 A:V.scophthalmi，1 :酶切圖譜，2:LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，M=Marker; B:V.ichthyoenteri，l:酶切圖譜，2:LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物M:Marker。
[0018] 圖4大菱解弧菌和魚腸道弧菌雙重LAMP檢測方法與普通PCR檢測方法的靈敏度 比較M=Marker;l-81.2X107CFU/ml-1.2X100CFU/mlCFU/ml;N:negativecontrol。
[0019] 圖5特異性結(jié)果統(tǒng)計(jì)只有大菱解弧菌和魚腸道弧菌有擴(kuò)增，其他菌均沒有擴(kuò)增。
[0020] 圖6雙重LAMP檢測方法的應(yīng)用-SYBRGreenI法顯色反應(yīng)對人工感染的大菱解 魚的肝、腎、脾、血進(jìn)行雙重LAMP擴(kuò)增，產(chǎn)物加入SYBRGreenI，感染組顯示綠色，對照組無 變化。1，3,5,7:(感染組4:感染大菱解弧菌巧：感染魚腸道弧菌）脾、腎、肝、血。2,4,6， 8 :(健康組）脾、腎、肝、血。
[0021] 圖7雙重LAMP檢測方法的應(yīng)用-平板計(jì)數(shù)法結(jié)合雙重LAMP計(jì)數(shù)細(xì)菌的最低檢 出率。
【具體實(shí)施方式】： W下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述： 實(shí)施例1 1大菱解弧菌和魚腸道弧菌雙重LAMP方法的建立 1. 1材料 dNTPs、BstDNA聚合酶（含10X緩沖液）、PCR級甜菜堿 1. 2方法 1.2. 1引物設(shè)計(jì)與合成 設(shè)計(jì)LAMP引物：根據(jù)GeneBank中已知V.scophthalmi的IuxR(GenBank:JN684209. 1) 和V.ichthyoenteri的ToxR基因（GenBank:KT265743)作為勒!序列，通過PrimerExplore V4在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)四條特異性引物，對于V.scophthalmi，在FIP的Flc和F2之間添加 Eco