一種檢測(cè)mpl基因突變的引物與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種檢測(cè)MI^L基因突變的引物與方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓增值性腫瘤（MPN)是由造血前體細(xì)胞生長(zhǎng)激活基因改變導(dǎo)致的多細(xì)胞系過(guò)度 增殖而引起的，包括真性紅細(xì)胞增多癥（PV)、原發(fā)性血小板增多癥（ET)和原發(fā)性骨髓纖維 化（PMF)。骨髓增值性腫瘤若不及時(shí)治療，最終可能發(fā)展呈急性粒細(xì)胞性白血病。MI^L基因 編碼人血小板生成素受體（TPOR)，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化。人血小板生成素受體參與 調(diào)控巨核細(xì)胞的增殖與血小板的生成，對(duì)造血干細(xì)胞的維護(hù)起著重要的作用。MI^L基因跨膜 區(qū)域的體細(xì)胞突變首先由Pikman等在JAK2V617F突變陰性的PMF患者中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為與 JAK2V617F突變陰性的MPN患者中JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生持續(xù)性激活有關(guān)。
[0003] 現(xiàn)有研究表明，MI^L基因突變主要發(fā)生在外顯子10第515位密碼子上（W5巧L, W515K，W515R和W515A)，約 8. 5% 的JAK2V617F突變陰性的ET和約 15% 的JAK2V617F突 變陰性的PMF患者可檢測(cè)到MPL基因突變，但在PV患者中未發(fā)現(xiàn)MPL基因突變。MPLW515 突變是JAK2V617F陰性的MPN患者的致病因素之一。
[0004] 中國(guó)專利申請(qǐng)201210374903. 7公開了一種檢測(cè)MPL基因W515位點(diǎn)突變的試劑 盒，該試劑盒包括位點(diǎn)突變特異性引物、內(nèi)參基因ABL引物和巧光探針等，用于MI^L基因 W515位點(diǎn)突變的檢測(cè)存在存在反應(yīng)體系復(fù)雜，需要多種引物和巧光定量PCR儀的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種檢測(cè)M化基因突變的引物與方 法，該引物具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)MI^L基因外顯子10突變的準(zhǔn)確檢 測(cè)。
[0006] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)M化基因突變的引物，包括針對(duì)M化基因外顯子10的上游引 物TGTAAAACGACGGCCAGTTGACCTTGCGGGCCGAC(沈QIDNO. 1)和下游引物CAGGAAACAGCTATG ACCGATCTGGGGTCACAGAGCGA(沈QIDNO. 2)。
[0007] 優(yōu)選地，所述引物中，外顯子10的上游引物和外顯子10的下游引物濃度比為1: Io
[0008] 相應(yīng)地，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)M化基因突變的方法，包括如下步驟:A)提取DNA 樣品；B)采用權(quán)利要求1或2中所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分 析后，采用Sanger測(cè)序法檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟A)中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血或骨髓血的DNA樣品。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟B)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段1 :98°CSmin;階段2 :98°C 1〇3;階段3:631：3〇3;階段4:72°(：1111111;階段5:返回到階段2,34個(gè)循環(huán)；階段6:721： Smin;階段7 :25 °C保溫。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟C)中，采用Sequencher4. 1. 4軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
[001引此外，本發(fā)明還提供檢測(cè)M化基因突變的引物在制備檢測(cè)M化基因突變?cè)噭┲械?用途。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種檢測(cè)MI^L基因外顯子 10突變的引物，該引物的特異性好，準(zhǔn)確性好，提高了檢測(cè)效率。此外，本發(fā)明還提供了一種 檢測(cè)MI^L基因外顯子10突變的方法，通過(guò)使用特異性的引物，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn) 確性好等優(yōu)點(diǎn)，可作為JAK2V617F陰性的ET和PMF患者的輔助檢測(cè)方法，進(jìn)而為其臨床用 藥提供指導(dǎo)。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1本發(fā)明提供的MPL基因外顯子10引物的擴(kuò)增片段。 陽(yáng)01引圖2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
[0016]圖3 MPL基因外顯子10野生型的部分測(cè)序圖。 陽(yáng)017] 圖4 MPL基因外顯子10突變型的部分測(cè)序圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0019] 實(shí)施例一引物 發(fā)明人針對(duì)MI^L基因外顯子10,設(shè)計(jì)了大量引物，通過(guò)引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和比較，篩 選出了特異性好的引物。
[0020]
實(shí)施例二引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進(jìn)行Blasting,MI^L基因外顯子10引物擴(kuò)增片段位于C虹1: 43814796-43815124間，長(zhǎng)度為329bp。無(wú)其它同源基因，結(jié)果如圖1所示，與MPL 基因參考序列相符。
[OOW使用表1中的引物、表2中的PCR擴(kuò)增體系和表3的PCR擴(kuò)增條件對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn) 行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性高， 無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。 陽(yáng)02引實(shí)施例SM化基因外顯子10突變的檢測(cè) 提取邸TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANampBloodDNAKit(購(gòu)自Tiagen,貨號(hào)：DP318)的說(shuō)明書，將DNA樣品稀釋至l(K)ng/iiL備用。 陽(yáng)02引 PCR擴(kuò)增采用Q5?熱啟動(dòng)超保真2X Master Mix(購(gòu)自肥B公司，貨號(hào)：M049化）， PCR擴(kuò)增體系如表2所示，PCR擴(kuò)增條件如表3所示。外顯子10的上游引物和外顯子10的 下游引物濃度比為1 :1，外顯子10的上游引物濃度和外顯子10的下游引物濃度都為IOp/ mol O
[0024]
對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性高， 無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。采用Bi曲ye? Terminator v3.1(購(gòu)自Life司，貨號(hào)4336919) 對(duì)檢測(cè)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序，Sanger測(cè)序的操作步驟如下： A)DNA測(cè)序模板處理，加入ExoSAP-口酶，在ABI9700PCR儀中，按W下程序進(jìn)行處理： 37 °C，15min;80 °C，15min;4°C，infinite。
[00巧]B)參考Bi曲ye?Terminatorv3.I切cleSequencingKit操作說(shuō)明制備測(cè)序PCR體系。
[0026] C)在ABI9700PCR儀中，按W下程序進(jìn)行處理： 96°C，1min-（96°C，10S- 50°C，5S- 60°C，4min)，25 個(gè)循環(huán)一 4°C保溫。
[0027] D)用酒精/EDTA/NaAc法對(duì)測(cè)序PCR的產(chǎn)物進(jìn)行純化。
[0028] 巧室溫?fù)]發(fā)凈酒精，加入IOyL化-Di化rmamide溶解DNA，溶解后的樣品需要在 95°C變性4 min,迅速置冰中冷卻4 min后，上樣電泳。
[0029] 測(cè)序結(jié)果(僅顯示部分）如圖3至圖4所示，擴(kuò)增產(chǎn)物的序列與參考序列相符。
[0030] 實(shí)施例四檢測(cè)M化基因外顯子10突變的方法的準(zhǔn)確性 本檢測(cè)準(zhǔn)確性定義為不同引物檢測(cè)結(jié)果的一致性。
[0031] 本檢測(cè)方法使用表1中的檢測(cè)引物對(duì)22例血液樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，此外，使用表 4中的驗(yàn)證引物對(duì)22例血液樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。22例樣品經(jīng)兩套不同引 物檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果一致，表明本檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性為100%。
[0032]
注：NMD即未檢測(cè)到突變。
[003引實(shí)施例五檢測(cè)M化基因外顯子10突變的方法的特異性和靈敏度 本檢測(cè)的檢測(cè)特異性定義為陰性符合率，檢測(cè)靈敏度定義為陽(yáng)性符合率。
[0034] 本檢測(cè)方法使用表1中的檢測(cè)引物對(duì)22例血液樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，此外，使用表 4中的驗(yàn)證引物對(duì)22例血液樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。檢測(cè)引物和驗(yàn)證引物檢 測(cè)結(jié)果為陰性（未檢測(cè)到突變）的樣品完全一致，本檢測(cè)方法的檢測(cè)特異性為100%。
[0035] 檢測(cè)引物和驗(yàn)證引物檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性（檢測(cè)到突變）的樣品完全一致，突變位點(diǎn) 及類型也完全一致，結(jié)果如表6所示，本檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度為100%。
[0036]
實(shí)施例六檢測(cè)MI^L基因外顯子10突變的方法的檢測(cè)下限 本檢測(cè)方法采用Sanger測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，本檢測(cè)方法的最低檢測(cè)下限化OD)為20%，當(dāng) 突變細(xì)胞與正常細(xì)胞的比值低于40%時(shí)，不排除假陰性的可能。
[0037] DNA輸入量的檢測(cè)結(jié)果如表8所示，在DNA量輸入范圍12. 5~200ng/reaction間， 可保證突變樣品檢測(cè)結(jié)果一致。
[003引實(shí)施例屯檢測(cè)M化基因外顯子10突變的方法的精密度 本檢測(cè)方法的精密度定義為對(duì)樣品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)得到同一結(jié)果的能力。
[0039] 本檢測(cè)方法對(duì)7例樣品進(jìn)行了MI^L基因外顯子10的S次重復(fù)檢測(cè)。同一樣品不 同批次的擴(kuò)增均成功，Sanger測(cè)序結(jié)果如表7所示。結(jié)果顯示，同一樣品不同批次的檢測(cè) 結(jié)果一致，本檢測(cè)方法批間精密度為100%。
[0040]
注：NMD即未檢測(cè)到突變。 陽(yáng)0川本檢測(cè)方法對(duì)1例陽(yáng)性樣品和1例陰性樣品進(jìn)行了M化基因外顯子10的3復(fù)孔 檢測(cè)。同一樣品不同孔間的擴(kuò)增均成功，Sanger測(cè)序結(jié)果如表8所示。結(jié)果顯示，同一樣 品不同孔間的檢測(cè)結(jié)果一致，本檢測(cè)方法的批內(nèi)精密度為100%。
[0042]
注：NMD即未檢測(cè)到突變。
[0043]因此，本發(fā)明所提供的引物和檢測(cè)方法可作為一種獨(dú)立的、應(yīng)用廣泛的檢測(cè)方法， 解決了MPL基因外顯子10突變的檢測(cè)問(wèn)題，可作為JAK2V617F陰性的ET和PMF患者的輔 助檢測(cè)方法，進(jìn)而為其臨床用藥提供指導(dǎo)，減少不良反應(yīng)，在幫助指導(dǎo)用藥和個(gè)性化治療方 面具有重要意義。
[0044] W上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于運(yùn)些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)MPL基因突變的引物，其特征在于：包括針對(duì)MPL基因外顯子10的上游引 物 TGTAAAACGACGGCCAGTTGACCTTGCGGGCCGAC 和下游引物 CAGGAAACAGCTATGACCGATCTGGGGTC ACAGAGCGAo2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)MPL基因突變的引物，其特征在于：所述引物中，外顯子 10的上游引物和外顯子10的下游引物濃度比為1 :1。3. -種檢測(cè)MPL基因突變的方法，其特征在于：包括如下步驟：A)提取DNA樣品；B)采 用權(quán)利要求1或2中所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析后，采用 Sanger測(cè)序法檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)MPL基因突變的方法，其特征在于：所述步驟A)中的DNA 樣品為EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA樣品。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)MPL基因突變的方法，其特征在于：所述步驟B)中的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：階段I :98°C 3min ;階段2 :98°C IOs ;階段3 :63°C 30s ;階段4 :72°C 11^11;階段5:返回到階段2,34個(gè)循環(huán)；階段6:72 1€51^11;階段7:25°(：保溫。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)MPL基因突變的方法，其特征在于：所述步驟C)中，采 用Sequencher 4. 1. 4軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。7. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)MPL基因突變的引物在制備檢測(cè)MPL基因突變?cè)噭?中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)MPL基因突變的引物，包括針對(duì)MPL基因外顯子10的上游引物和下游引物。本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供的引物可以實(shí)現(xiàn)MPL基因外顯子10突變的特異性檢測(cè)，引物的特異性好，準(zhǔn)確性好，提高了檢測(cè)效率。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號(hào)】CN105154545
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510568599
【發(fā)明人】燕啟江, 趙薇薇, 于世輝, 梁耀銘, 胡昌明
【申請(qǐng)人】廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月9日