微生物的培養(yǎng)”或“微生物培養(yǎng)”是指用于在預定培養(yǎng)基中通過復制而繁殖微生物的方法或系統(tǒng)，包括在受控的實驗室條件下。使用微生物學的培養(yǎng)、微生物的培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)來繁殖生物，以確定生物的類型，或生物在被測試的樣品中的豐度。在液體培養(yǎng)基中，術(shù)語微生物學的、微生物的或微生物培養(yǎng)一般是指整個液體基以及液體基中的微生物，與培養(yǎng)所在的容器無關(guān)。液體基常常被稱為“介質(zhì)”、“培養(yǎng)基”或“培養(yǎng)介質(zhì)”。當強調(diào)多元微生物時，培養(yǎng)的行為一般被稱為“培養(yǎng)微生物”。當重點放在微生物的種或?qū)贂r，培養(yǎng)的行為一般被稱為“培養(yǎng)微生物”。微生物培養(yǎng)與微生物的培養(yǎng)同義使用。
[0028]可在兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下生長的微生物包括微藻、娃藻和藍藻。兼養(yǎng)型微生物的非限制性示例可包括下列屬的生物:阿格藻、雙眉藻、魚腥藻、囊藻、頂絲藻、中肋藻、節(jié)旋藻(螺旋藻)、葡萄藻、咸胞藻、衣藻、小球藻、綠球藻、十字扁盤石藻、筒柱藻、綠群藻、藍載藻、小環(huán)藻、杜氏藻、艾密里藻、裸藻、無管眼藻、脆桿藻、紅藻、角毛藻、紅球藻、綠藻、球等鞭金藻、丹麥細柱藻、微星藻、直鏈藻、蒜頭藻、念珠藻、微球藻、微綠球藻、舟形藻、土壤綠藻、新月藻、齒狀藻、棕鞭藻、赭球藻、巴夫藻、俄克拉何馬綠藻、三角褐指藻、中肋藻、紫球藻、金藻、小三毛金藻、紅胞藻、柵藻、骨條藻、泡沫藻、輻節(jié)藻、桿狀裂絲藻、Auxenochlorella、角毛藻、富油新綠藻、赭球藻、紫球藻、聚球藻、集胞藻、四另藻、破囊壺菌、海鏈藻及它們的種。
[0029]適合以兼養(yǎng)方式或以異養(yǎng)方式生長微生物的有機碳源可包括:酯、乙酸、亞油酸銨、阿拉伯糖、精氨酸、天冬氨酸、丁酸、纖維素、檸檬酸、乙醇、果糖、脂肪酸、半乳糖、葡萄糖、甘油、甘氨酸、乳酸、乳糖、馬來酸、麥芽糖、甘露糖、甲醇、糖蜜、胨、基于植物的水解產(chǎn)物、脯氨酸、丙酸、核糖、蔗糖、淀粉的部分或完全水解物、蔗糖、酒石酸、TCA循環(huán)有機酸、稀釜餾物、尿素、工業(yè)廢溶液、酵母提取物及它們的組合。有機碳源可包括任何單一源、源的組合以及單一源或源的組合的稀釋物。
[0030]術(shù)語“兼養(yǎng)的”和“兼養(yǎng)”是指可將光、有機碳和無機碳(例如，二氧化碳、碳酸鹽、碳酸氫鹽)應用到微生物的培養(yǎng)上的培養(yǎng)條件。能夠在兼養(yǎng)條件下生長的微生物具有光合微生物和異養(yǎng)微生物兩者的代謝方式，并且可使用光和有機碳兩者作為能量源，以及無機碳和有機碳兩者作為碳源。兼養(yǎng)型微生物可同時通過光合代謝和異養(yǎng)代謝來使用光、無機碳和有機碳，或者可在每種代謝的利用之間切換。取決于微生物所利用的能量源和碳源，兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下的微生物可以是凈氧或二氧化碳生產(chǎn)者。能夠兼養(yǎng)生長的微生物包括具有自然代謝和在兼養(yǎng)條件下生長的能力的微生物，以及通過諸如誘變或基因工程等方法通過細胞改造而獲得代謝和能力的微生物。
[0031]術(shù)語“光合”、“光養(yǎng)”、“光合自養(yǎng)”、“光自養(yǎng)”和“自養(yǎng)微生物”是指可將光和無機碳(例如，二氧化碳、碳酸鹽、碳酸氫鹽)應用到微生物的培養(yǎng)上的培養(yǎng)條件。能夠在光合條件下生長的微生物可使用光作為能量源并且使用無機碳(例如，二氧化碳)作為碳源。光合條件下的微生物可生產(chǎn)氧。
[0032]術(shù)語“異養(yǎng)的”和“異養(yǎng)”是指在沒有光的情況下可將有機碳應用到微生物的培養(yǎng)上的培養(yǎng)條件。能夠在異養(yǎng)條件下生長的微生物可使用有機碳作為能量源和碳源兩者。異養(yǎng)條件下的微生物可生產(chǎn)二氧化碳。
[0033]術(shù)語“無菌”描述的是完全沒有所有其它“污染”的生物(即，對微藻或藍藻培養(yǎng)的健康有害的生物)的生物培養(yǎng)。在整個說明書中，無菌是指當接種于具有細菌培養(yǎng)基的瓊脂板中時培養(yǎng)并不形成除關(guān)注的微生物以外的任何菌落。無菌描述的是不被任何其它活生物體(諸如但不限于細菌、藍藻、微藻和/或真菌)污染或者不與之關(guān)聯(lián)的培養(yǎng)。通常使用無菌來指完全不存在其它的不同生物的微生物的單純培養(yǎng)。微藻或藍藻的無菌培養(yǎng)完全沒有其它的不同生物。
[0034]術(shù)語“恒pH培養(yǎng)”是指將新鮮培養(yǎng)基(例如，包含諸如乙酸等有機碳的培養(yǎng)基)的添加與PH控制結(jié)合的微生物的培養(yǎng)技術(shù)。在pH從給定的設定點漂移時，添加新鮮培養(yǎng)基，以將pH帶回設定點。pH改變的速率常常是生長的優(yōu)良指標并且滿足生長相關(guān)參數(shù)的要求。進料將保持殘余養(yǎng)分濃度與培養(yǎng)基的緩沖能力平衡。取決于當時存在于培養(yǎng)物中的微生物，PH設定點可改變。存在的微生物可受到生物反應器運轉(zhuǎn)的位置和季節(jié)以及安置的培養(yǎng)與其它污染源(例如，其它農(nóng)場、農(nóng)業(yè)、海洋、湖泊、河流、廢水)的距離的驅(qū)動。介質(zhì)添加的速率由限制性養(yǎng)分的緩沖能力和進料濃度確定并且不像常規(guī)恒態(tài)培養(yǎng)中那樣由設定點(pH)直接確定。恒pH培養(yǎng)是穩(wěn)健的但間接控制養(yǎng)分濃度。pH水平代表在碳及養(yǎng)分攝取期間不同離子物質(zhì)的產(chǎn)生和離子釋放的總和。因此，PH水平可以或上或下地移動，作為微生物生長的函數(shù)。最常見的情況是由有機酸產(chǎn)生和氨攝取造成的PH降低。然而，對于蛋白質(zhì)或富含氨基酸的介質(zhì)上的微生物生長，因為釋放了過量的氨，PH水平將隨著生長而上升。
[0035]概述
[0036]當在兼養(yǎng)條件下培養(yǎng)微生物時，光、無機碳和有機碳的施加提供了多種培養(yǎng)輸入，包括可被目標微生物(例如，微藻和藍藻)和污染生物(例如，真菌、細菌、輪蟲、纖毛蟲)兩者利用的能量源。污染生物的存在、溶解的氣體的平衡以及養(yǎng)分和能量源的可用性在利用小容積、短培養(yǎng)時間以及室內(nèi)控制條件的實驗室規(guī)模下沒必要解決。
[0037]在室外大規(guī)模兼養(yǎng)生產(chǎn)系統(tǒng)中，污染生物的抑制培養(yǎng)物中的目標微生物的潛力可影響大規(guī)模生產(chǎn)的兩種途徑。第一途徑包括未在無菌條件下運轉(zhuǎn)的開放或半封閉系統(tǒng)。在這樣的非無菌系統(tǒng)中，生產(chǎn)系統(tǒng)和培養(yǎng)方法可設計成處理污染微生物的量和多樣性。第二途徑包括在無菌條件下運轉(zhuǎn)的封閉系統(tǒng)。在這樣的無菌系統(tǒng)下，生產(chǎn)系統(tǒng)可設計成在沒有污染生物的情況下維持封閉系統(tǒng)中的適當?shù)呐囵B(yǎng)條件。在一些實施方式中，所描述的生物反應器可在無菌條件下運轉(zhuǎn)。在一些實施方式中，所描述的生物反應器可在非無菌條件下運轉(zhuǎn)。在一些微生物物種偏愛于僅在非無菌條件下生長的情況下，相比于使用無菌發(fā)酵器的系統(tǒng)可得的情況，本文中描述的開放和非無菌的實施方式提供了在兼養(yǎng)條件下培養(yǎng)更大范圍的微生物的潛力。
[0038]兼養(yǎng)型生物反應器系統(tǒng)可包括:培養(yǎng)容器，所述培養(yǎng)容器具有被構(gòu)造成包含兼養(yǎng)型微生物的水性培養(yǎng)物的內(nèi)容積；用于使所述內(nèi)容積暴露至至少一些光(自然光、人工光或它們的組合)的至少一個照明裝置或部件(例如，具有一些透明度的開口或窗口)；以及有機碳供給裝置。在一些實施方式中，兼養(yǎng)型生物反應器系統(tǒng)可進一步包括無機碳(例如，二氧化碳、碳酸氫鹽)的供給。在一些實施方式中，兼養(yǎng)型生物反應器系統(tǒng)可進一步包括:自動化傳感器和控制系統(tǒng)；可編程邏輯控制系統(tǒng)；至少一個傳感器，用于檢測培養(yǎng)參數(shù)，諸如溫度、pH、溶解氧、溶解二氧化碳、流量、濁度和感光色素或類胡蘿卜素；用于使培養(yǎng)物混合并循環(huán)的至少一個部件；氣體供給(例如，空氣、氧氣、氮氣)；以及至少一個熱交換器。在一些實施方式中，兼養(yǎng)型生物反應器系統(tǒng)可至少部分地布置在室外。在一些實施方式中，兼養(yǎng)型生物反應器系統(tǒng)可至少部分地布置在室內(nèi)。在一些實施方式中，兼養(yǎng)型生物反應器系統(tǒng)可包括蓋，所述蓋至少部分地遮蔽微生物培養(yǎng)物使其免受諸如光、溫度、熱、風、空氣傳播的顆粒和降水等環(huán)境要素的影響。在一些實施方式中，生物反應器可包括:被構(gòu)造成允許使培養(yǎng)容器的內(nèi)容積至少部分暴露至人工光或自然光的培養(yǎng)容器，諸如但不限于，罐、袋、池、跑道池或槽；以及有機碳供給裝置。
[0039]溶解氧(DO)分布
[0040]用實驗室規(guī)模生物反應器未解決的一個挑戰(zhàn)是將溶解氧在生物反應器容積內(nèi)的分布。雖然當利用光作為能量源并且利用無機碳作為碳源時兼養(yǎng)型微生物可生產(chǎn)氧，但是當利用有機碳作為能量和碳源時氧被消耗。因此，維持培養(yǎng)物中的溶解氧水平對于維持由有機碳的利用所驅(qū)動的生長速率是重要的。在小容積的生物反應器中，溶解氧含量可能在橫跨兼養(yǎng)培養(yǎng)物的深度上是相對均勻的。此外，可以以基本均勻的方式容易地照射小容積的生物反應器，因此允許實驗室規(guī)?；蛐⌒蜕锓磻髦械乃形⑸锏拇x以基本上相同的方式運作。
[0041 ] 當生物反應器的深度增加時，在混合并未充分使溶解氣體以均勻的方式分布時，溶解氧的梯度分布可形成在生物反應器的整個深度上。由于生物反應器的深度，大容積的生物反應器的照明還可能不是均勻的。在一個非限制性示例中，光可能在開放池生物反應器的空氣/液體界面的短距離(例如，小于1cm)內(nèi)可用，并且依靠混合來使微生物周期性地循環(huán)通過不同深度的培養(yǎng)容積而將微生物暴露至間歇的光。
[0042]在光路距離下方，可用的能量源將是兼養(yǎng)培養(yǎng)中的有機碳。因此，在兼養(yǎng)培養(yǎng)中可能有助于溶解氣體的分布的因素可包括:1)在生物反應器系統(tǒng)中使用的混合方式，以及該混合方式均勻混合和分布溶解氣體的能力；2)空氣/液體界面處的氣體損失(例如，并未溶解于水性介質(zhì)中的氣泡的爆裂)；3)氣體供給在生物反應器系統(tǒng)內(nèi)的位置(例如，在生物反應器的最深部處，在空氣/液體界面與生物反應器的最深部之間，在湍流區(qū)域內(nèi)，在層流區(qū)域內(nèi));4)供給的氣體氣泡在培養(yǎng)物內(nèi)的駐留時間；5)由于代謝活性和可用的能量源所致的微生物對氣體的消耗率；以及6)由于代謝活性和可用的能量源所致的微生物的氣體產(chǎn)生。
[0043]大規(guī)模生物反應器可使兼養(yǎng)型微生物循環(huán)通過生物反應器的容積以及溶解氧濃度的分布。循環(huán)通過大規(guī)模生物反應器的深度可允許兼養(yǎng)型微生物最大化地利用不同位置中的可用能量源以供生長和產(chǎn)品開發(fā)，而不會遇到快速改變培養(yǎng)條件的壓力。
[0044]在一些實施方式中，生物反應器最深部處和空氣/液體界面處的培養(yǎng)基中的溶解氧濃度可在10%?500%之間變化，包括最深部處的濃度比空氣/液體界面處的溶解氧濃度大1%?500%。當空氣或氧引入裝置布置在反應器的底部處或附近時，最深部處和空氣/液體界面處的溶解氧濃度差可能是最大的。在一個非限制性示例中，生物反應器的深度可能使得溶解氧濃度可在約lg/L?1.lg/L-5g/L之間變化。在一些實施方式中，生物反應器的深度可大于0.5米。在一些實施方式中，生物反應器中的水性培養(yǎng)物的深度可介于0.5米?10米之間，并