使用粘土礦物和堿性溶液制備含核酸樣品的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】使用粘±礦物和堿性溶液制備含核酸樣品的方法
[0001] 政府權(quán)益聲明
[0002] 本文所述的工作由美國(guó)陸軍醫(yī)學(xué)研究購(gòu)置活動(dòng)化S.ArmyMedicalResearch AcquisitionActivity)撥款提供部分資金，合同號(hào)為W81XWH-10-2-0158。美國(guó)政府對(duì)本 發(fā)明享有一定的權(quán)利。 柳的]背景
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明一般地設(shè)及用于處理樣品的方法，所述樣品用于分子診斷應(yīng)用。
[OCX)日]相關(guān)技術(shù)描述
[0006] 許多診斷、研究、和研發(fā)程序需要檢測(cè)生物樣品中存在的特定核酸值NA或RNA)序 列。例如，核酸檢測(cè)方法用于鑒別細(xì)菌、病毒、或其它微生物，它們的存在可W說(shuō)明感染性疾 病的原因。核酸生物標(biāo)志物是幾種對(duì)全球衛(wèi)生有高度重要性的感染性疾病，包括人免疫缺 陷病毒化IV)、丙型肝炎病毒（HCV)、乙型肝炎病毒（皿V)、流行性感冒、和登革熱的目標(biāo)分 析物。更復(fù)雜樣本，例如人組織的樣品的測(cè)試也越來(lái)越普遍，其目的是確定與癌癥或遺傳病 相關(guān)的突變的存在。生物組織，例如從犯罪現(xiàn)場(chǎng)直接采集的血液中的核酸的檢測(cè)，也被用于 確定作為樣品來(lái)源的個(gè)體的身份，如，例如，親子鑒定或法醫(yī)分析。
[0007] 在核酸分子可W進(jìn)行上述所說(shuō)的任何目的的檢測(cè)之前，必需使生物材料樣品中的 特定的感興趣核酸達(dá)到可用的狀態(tài)。從生物樣本中釋放核酸的過(guò)程在本領(lǐng)域中通常被稱(chēng)為 "樣品制備"。祀核酸常常被包含在病毒顆粒、細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、或更復(fù)雜的生物體的細(xì) 胞，例如人白細(xì)胞內(nèi)。
[0008] 在樣品制備過(guò)程中，細(xì)胞或病毒顆?？蒞進(jìn)行化學(xué)或酶學(xué)處理W使膜和蛋白質(zhì)包 膜溶解或變性，從而導(dǎo)致核酸的釋放。運(yùn)種溶解過(guò)程通常被稱(chēng)為"裂解"，所得到的含有運(yùn)種 裂解物質(zhì)的溶液被稱(chēng)為"裂解物"或"提取物"。可惜地是，運(yùn)種釋放使核酸暴露，會(huì)受到樣 品中存在的內(nèi)源核酸酶的降解，所述內(nèi)源核酸酶存在的豐度可W使得在核酸釋放之后立即 開(kāi)始降解。在后續(xù)純化過(guò)程中殘余的任何核酸酶都可W繼續(xù)降解完整的核酸，導(dǎo)致祀分子 從樣品中消失。核酸酶在大多數(shù)生物樣品中都是高豐度的，并且通常極能抵抗已知使其它 酶失活的處理。特別是，核糖核酸酶（RNases)即使不是在所有的生物樣品中，也是在大部 分生物樣品中是有活性的，特別是血液，而血液是最常收集的用于診斷目的的組織。除了核 酸酶之外，許多其他蛋白質(zhì)和污染物常常存在于生物樣品中，和/或在裂解物的制備過(guò)程 中被釋放。例如，血液樣品可W包括血紅素和肝素（在抽血過(guò)程中使用的一種抗凝劑），它 們干擾和/或抑制許多下游的分析步驟。
[0009] 為了克服生物裂解物中存在的核酸酶和其它不希望的產(chǎn)物的問(wèn)題，有必要設(shè)計(jì)復(fù) 雜的具有失活酶W及進(jìn)一步純化核酸二者的方案。例如，陰離子去垢劑和離液劑，例如硫氯 酸脈，已被用于在從細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中釋放核酸的同時(shí)失活或抑制核酸酶活性。為了進(jìn) 一步從裂解物中純化核酸，本領(lǐng)域中通常是使用低分子量的醇類(lèi)使核酸從溶液中沉淀。由 于在運(yùn)些條件下，其它大分子也會(huì)沉淀，產(chǎn)生包裹著核酸的粘性的、難處理的物質(zhì)，在進(jìn)行 乙醇沉淀之前常常必需借助于含有酪、和/或氯仿的危險(xiǎn)有機(jī)溶劑混合物來(lái)提取樣品。
[0010] 在制備用于RNA分析的樣品中的另外一個(gè)挑戰(zhàn)是保護(hù)運(yùn)些不穩(wěn)定分子的完整性。 不像DNA，RNA非常易于水解。因此，雖然可W在嚴(yán)格的條件下從生物樣品制備含DNA的裂 解物，用于RNA分析的樣品的制備通常需要使用穩(wěn)定劑、核酸酶抑制劑和冷藏和/或冷凍。 兩種方法的變形形式曾被用于制備來(lái)自生物樣品的RNA:化學(xué)提取和固定在玻璃上，通常 被稱(chēng)為"固相提取"。如上所述，化學(xué)提取通常使用高度濃縮的離液鹽和酸性酪或酪-氯仿 溶液來(lái)使RNases失活，并從其它生物分子中純化RNA。運(yùn)些方法提供了非常純的RNA制備 物；但是，通常必須用醇沉淀步驟對(duì)RNA進(jìn)行脫鹽和濃縮。固相提取方法，在Boometal的 美國(guó)專(zhuān)利No. 5, 234, 809中描述，依賴(lài)于離液試劑硫氯酸脈的裂解和核酸酶失活特性，W及 運(yùn)種試劑存在時(shí)的固態(tài)二氧化娃顆?；蛲拊孱?lèi)的核酸結(jié)合性質(zhì)。用含有乙醇的高鹽緩沖液 洗涂與二氧化娃結(jié)合的RNA之后，在低離子強(qiáng)度的緩沖液中洗脫RNA。
[0011] 容易理解，需要使用有機(jī)溶劑或離液劑進(jìn)行水相提取的樣品制備方法是冗長(zhǎng)的、 危險(xiǎn)的、勞動(dòng)強(qiáng)度大的、和速度慢的。而且，如果在進(jìn)行運(yùn)些程序的時(shí)候沒(méi)有特別小屯、，可能 發(fā)生核酸酶的殘余污染，樣本核酸會(huì)被降解或消失。用運(yùn)種樣品進(jìn)行的診斷測(cè)試可能由于 運(yùn)種降解而給出假陰性結(jié)果。假陰性結(jié)果還可W由于化學(xué)干擾造成，例如來(lái)自于殘留的陰 離子去垢劑、離液鹽、或樣品中殘余的并且會(huì)抑制祀序列擴(kuò)增程序的乙醇。如果已經(jīng)使用了 陰離子去垢劑和蛋白酶，殘余的蛋白水解活性也可能降解祀序列擴(kuò)增和/或雜交檢測(cè)反應(yīng) 中使用的酶，并產(chǎn)生假陰性結(jié)果。在'809專(zhuān)利中公開(kāi)的基于"爆轟裂解度oomlysis)"方 案的樣品制備方法通常被認(rèn)為是充分應(yīng)對(duì)了運(yùn)些問(wèn)題。但是，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，運(yùn) 些提取方法，即使用離液鹽結(jié)合固相提取，在制備用于皿V基因組的WPCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)的 血液或血漿樣品時(shí)，并不總是有效的。因此，上述的方案均不適于從復(fù)雜生物起始材料，例 如全血或血清中制備用于同時(shí)檢測(cè)DNA和RNA祀序列的通用樣品。運(yùn)對(duì)于在臨床實(shí)驗(yàn)室條 件下和在資源缺乏地區(qū)的傳染病診斷來(lái)說(shuō)的是千真萬(wàn)確的，在臨床實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)時(shí)間的 要求非常高，在資源缺乏地區(qū)，成本效益、減少有毒廢物流和簡(jiǎn)易性也很重要。
[0012] 雖然在該領(lǐng)域取得了進(jìn)展，在本領(lǐng)域中仍然存在不同樣品核酸的提取和含核酸溶 液的制備方法的需要。本發(fā)明滿足了運(yùn)些需要并進(jìn)一步提供了相關(guān)的益處。 陽(yáng)〇1引發(fā)明簡(jiǎn)述
[0014] 本發(fā)明的實(shí)施方案提供樣品制備方法，所述方法克服了已知過(guò)程的缺陷。特別地， 本發(fā)明的實(shí)施方案的目的是提供樣品制備方法，所述方法使得能夠同時(shí)檢測(cè)來(lái)自普通樣 品，例如生物樣品的DNA和RNA祀。本發(fā)明提供了前所未有的快速的、簡(jiǎn)單的、和可再現(xiàn)的 方法，W提供無(wú)損傷狀態(tài)的并且具有低污染風(fēng)險(xiǎn)的核酸，W使得運(yùn)種樣品可W被立即用作 診斷分析中的試劑。本發(fā)明的實(shí)施方案是基于運(yùn)樣的樣品制備方法，其中樣品在提取或裂 解之前用粘±礦物進(jìn)行處理。然后，用堿性溶液處理樣品，W從含有感興趣核酸的細(xì)胞或病 毒顆粒釋放核酸（"堿裂解"）。
[0015] 本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，用粘±礦物對(duì)樣品（例如生物樣品）進(jìn)行預(yù)處理保護(hù) 核酸分子，特別是RNA，在堿裂解過(guò)程中不被水解。根據(jù)本發(fā)明方法的粘±礦物的使用還保 護(hù)核酸不發(fā)生核酸酶介導(dǎo)的降解。有利地，發(fā)現(xiàn)組合使用粘±礦物和堿溶液的方法使得含 核酸樣品的制備不含抑制酶和/或降解酶和/或其它污染物，其足W使得該樣品可W直接 用于檢測(cè)測(cè)定，例如核酸擴(kuò)增程序，而無(wú)需任何進(jìn)一步的純化步驟。因此，本發(fā)明的實(shí)施方 案提供快速的、簡(jiǎn)單的、和相對(duì)無(wú)危險(xiǎn)的復(fù)雜生物樣品制備方法，所述復(fù)雜生物樣品用于同 時(shí)檢測(cè)感興趣的DNA和RNA分子。本發(fā)明還特別適合于微型化，并且與自給式"忍片實(shí)驗(yàn) 室"微流體盒和其它診斷測(cè)試試劑盒和裝置兼容。相應(yīng)地，一些實(shí)施方案設(shè)及在微流體環(huán)境 中，例如在微流體卡上實(shí)施所公開(kāi)的方法。
[0016] 本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)當(dāng)基于堿裂解的方法包括用粘±礦物對(duì)樣品進(jìn)行處理 時(shí)，運(yùn)種方法可用于制備用于核酸分析的復(fù)雜生物樣品。本發(fā)明的方法可有利地用于制備 普通樣品，所述普通樣品用于同時(shí)檢測(cè)DNA和RNA祀分子。本發(fā)明的方法相對(duì)于已知的樣 品制備方法提供了改進(jìn)，所述改進(jìn)在于本發(fā)明的特定實(shí)施方案不需要在檢測(cè)前進(jìn)一步純化 或分離核酸。不受理論的束縛，相信粘±礦物提供幾種有益效果，包括，但不限于，保護(hù)核酸 在堿性條件下不被水解；保護(hù)核酸不發(fā)生核酸酶介導(dǎo)的降解；保護(hù)下游測(cè)定試劑，例如DNA 聚合酶不受測(cè)試樣品中存在的抑制劑和其它污染物影響；W及常規(guī)的緩沖性質(zhì)。根據(jù)本發(fā) 明制備的核酸樣品基本不含核酸酶活性，并且在用于修飾酶的時(shí)候是優(yōu)選的底物。本文公 開(kāi)的樣品制備方法在制備用于同時(shí)檢測(cè)DNA和RNA病毒的血液或血清樣品的制備上是特別 有利的。本發(fā)明的主要實(shí)施方案的主要特征在下文中總結(jié)。本發(fā)明的其它不同目的和益處 將會(huì)隨本發(fā)明的詳細(xì)描述和本文提供的實(shí)施例而顯而易見(jiàn)。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明設(shè)及處理用于核酸分析的含核酸樣品的方法。該方法 包括使樣品與粘±礦物接觸，使樣品與粘±礦物混合直至粘±礦物均勻分散在樣品中，從 樣品中基本上除去粘±礦物，使樣品與堿性溶液在適合于細(xì)胞和病毒顆粒裂解的抑下接 觸，W形成核酸溶液，W及，可選地，使核酸溶液與適合于中和核酸溶液的抑的酸性溶液接 觸。在前述的一些實(shí)施方案中，樣品是生物樣品，例如含有生物樣品的溶液。
[0018] 附圖簡(jiǎn)述
[0019] 圖1顯示了定量PCR分析，W檢測(cè)樣品中皿VDNA，所述樣品是對(duì)含皿V病毒顆粒 的人血漿進(jìn)行提取產(chǎn)生的，其依據(jù)的方案是基于堿裂解。
[0020] 圖2顯示了定量PCR分析，W檢測(cè)樣品中MS2RNA，所述樣品是對(duì)含有MS2RNA的人 血液進(jìn)行提取產(chǎn)生的，其依據(jù)的方案是基于用粘±礦物進(jìn)行處理，然后進(jìn)行堿裂解。
[0021] 圖3顯示了定量PCR分析，W檢測(cè)樣品中MS2RNA，所述樣品是對(duì)含有MS2顆粒的人 血漿進(jìn)行提取產(chǎn)生的，其依據(jù)的方案是基于用粘±礦物進(jìn)行處理，然后進(jìn)行堿裂解。
[0022] 圖4顯示了定量PCR分析，W檢測(cè)樣品中HCVRNA，所述樣品是對(duì)含有HCV顆粒的 人血液進(jìn)行提取產(chǎn)生的，其依據(jù)的方案是基于用粘±礦物進(jìn)行處理，然后進(jìn)行堿裂解。 陽(yáng)02引 圖5顯示了定量PCR分析，W同時(shí)檢測(cè)樣品中的皿VDNA和肥VRNA，所述樣品是 對(duì)含有皿V和HCV顆粒的人血液進(jìn)行提取產(chǎn)生的，其依據(jù)的方案是基于用粘±礦物進(jìn)行處 理，然后進(jìn)行堿裂解。