抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制品制備技術(shù)及應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是涉及一種抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃海希瓦氏菌(ShewanellamarfIavi)是 Jung-Hoon Yoon 于 2004 年命名的，屬于希瓦氏菌屬。希瓦氏菌是主要的海洋病原菌之一。據(jù)報(bào)道黃海希瓦氏菌能感染牡蠣和仿刺參等海洋生物，是危害較高的菌種。
[0003]目前對(duì)于黃海希瓦氏菌引起的疾病的防治手段最主要的有以下幾種:抗生素、中草藥、單克隆抗體、滅活疫苗等?？股睾突瘜W(xué)藥物易引起應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)生物有不同程度的毒性，且反復(fù)使用容易產(chǎn)生耐藥性，存在藥物殘留，在倡導(dǎo)綠色農(nóng)業(yè)的今天必將退出歷史舞臺(tái)；中草藥的藥效持久，但卻很難迅速起效，且各地區(qū)中草藥藥性差別較大，使用不易控制，多用于疾病預(yù)防；疫苗接種是防治細(xì)菌性疾病最直接有效的方法，國(guó)外已經(jīng)有多種商品化疫苗出售，但我國(guó)水產(chǎn)疫苗研制起步較晚，到目前為止僅有草魚(yú)出血病疫苗獲得了商品化生產(chǎn)批準(zhǔn)，疫苗的研發(fā)、生產(chǎn)、銷(xiāo)售及廣泛使用都需要相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間。
[0004]卵黃抗體(IgY)是從經(jīng)抗原免疫的禽類(lèi)所產(chǎn)卵中分離的具有特異性的蛋白，它具有產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種易于生產(chǎn)、廉價(jià)的抗體，免疫I只雞所收集到的僅I個(gè)雞蛋中含有的IgY的量(約100mg-200mg)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于免疫I只兔所收集到的全部血清中的抗體量。IgY具有較強(qiáng)的耐酸、耐堿、耐熱能力。高效卵黃抗體可以通過(guò)注射、拌餌投喂、浸浴等方式對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物起到保護(hù)和疾病治療作用，還可用于免疫學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域。目前，卵黃抗體在畜牧業(yè)上已經(jīng)得到較廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，但在水產(chǎn)行業(yè)的研究開(kāi)發(fā)還處于基礎(chǔ)階段，目前在水產(chǎn)方面申請(qǐng)公開(kāi)和授權(quán)的專(zhuān)利有抗對(duì)蝦病毒、抗鰻弧菌、抗副溶血弧菌以及抗嗜水氣單胞菌的卵黃抗體，但是，目前還沒(méi)有關(guān)于抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法，該卵黃抗體純度較高，且對(duì)黃海希瓦氏菌有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)高免卵黃的獲取廉價(jià)、方便，便于低成本、大批量生產(chǎn)，其制備方法簡(jiǎn)便易行，可用于由黃海希瓦氏菌引起的疾病的預(yù)防和治療上及開(kāi)發(fā)黃海希瓦氏菌檢測(cè)試劑盒和進(jìn)行免疫學(xué)上的免疫反應(yīng)及診斷。
[0006]本發(fā)明的第一方面提供一種抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體，該卵黃抗體是用滅活黃海希瓦氏菌為抗原對(duì)蛋雞進(jìn)行免疫，收集該被免疫的蛋雞的雞蛋，對(duì)雞蛋卵黃中分離得到的水溶性組分，再進(jìn)行分離純化后得到的。
[0007]進(jìn)一步地，所述的蛋雞為120日齡的健康產(chǎn)蛋母雞。
[0008]本發(fā)明的第二方面，提供一種上述所述的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體的制備方法，該制備方法包括如下步驟:
[0009](I)抗原的制備:將黃海希瓦氏菌在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)至菌液濃度19CFU/mL，收集菌體，菌體用PBS稀釋后用甲醛滅活，得到滅活的黃海希瓦氏菌抗原；
[0010](2)免疫蛋雞:將步驟(I)得到的滅活的黃海希瓦氏菌抗原與弗式完全佐劑或弗式不完全佐劑按照等體積混合，乳化，制成弗式完全佐劑疫苗或弗式不完全佐劑疫苗；對(duì)蛋雞進(jìn)行免疫，共免疫三次，初免時(shí)使用完全弗式佐劑疫苗，二免和三免時(shí)使用弗式不完全佐劑疫苗；
[0011](3) 二免后每隔一周收集雞蛋一次，將收集的雞蛋清洗、消毒后，收集卵黃液，卵黃液中加入6倍體積的去離子水稀釋?zhuān){(diào)pH至5.0-5.2，4°C靜置過(guò)夜后，離心，收集上清液，用0.45 μ m濾膜過(guò)濾，濾液為水溶性組分；
[0012](4)將步驟(3)所得水溶性組分經(jīng)純化得到抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體。
[0013]在上述技術(shù)方案中，步驟(2)所述的對(duì)蛋雞的免疫方法為:初免時(shí)弗式完全佐劑疫苗的總注射劑量為每只蛋雞lmL，其中左右胸肌各注射0.2?0.4mL，頸部皮下注射
0.2?0.6mL ;初免2周后進(jìn)行二免，弗式不完全佐劑疫苗總注射劑量為每只蛋雞1.5mL，其中左右胸肌和頸部皮下各注射0.5mL ;二免2周后進(jìn)行三免，弗式不完全佐劑疫苗總注射劑量為每只蛋雞2mL，其中左右胸肌各0.5?0.8mL，頸部皮下注射0.4?lmL。
[0014]在上述所有技術(shù)方案中，步驟(4)所述的純化方法為:在步驟(3)得到的水溶性組分中加入硫酸銨至飽和度為50 %，混勻，待完全溶解后置4°C過(guò)夜；4°C下離心，用去離子水重新懸浮沉淀至原體積，再加入硫酸鈉至飽和度為14%，混勻，置室溫過(guò)夜；25°C下離心，用去離子水重新懸浮沉淀至原體積，得到抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體粗提液；將卵黃抗體粗提液用10KDa截留量的超濾膜包進(jìn)行超濾，超濾后得到的卵黃抗體提取液在_80°C條件下預(yù)凍2h，然后在真空度20Pa條件下進(jìn)行冷凍干燥，24h后獲得卵黃抗體凍干粉，4°C保存?zhèn)溆肙
[0015]在上述技術(shù)方案中，步驟(3)中得到的水溶性組分先進(jìn)行卵黃抗體效價(jià)測(cè)定后，選取抗體效價(jià)在1:10000以上的水溶性組分，再經(jīng)純化得到抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體。所述卵黃抗體的效價(jià)測(cè)定方法采用間接酶聯(lián)免疫吸附法。
[0016]在本發(fā)明中，采用上述制備方法制備得到的卵黃抗體(IgY)提取液，經(jīng)BSA法測(cè)得IgY濃度達(dá)到12mg/ml，經(jīng)SDS-PAGE測(cè)得IgY的純度達(dá)85%以上。
[0017]本發(fā)明的第三方面，提供上述所述的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體在制備治療黃海希瓦氏菌引起的疾病的制劑中的應(yīng)用。所述制劑優(yōu)選為藥物、保健品和飼料添加劑。具體為:將上述的方法制備得到的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體的水溶性組分或經(jīng)純化得到的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體純品按一定比例與輔料配比，制成不同的制劑，包括液態(tài)制劑、顆粒制劑、膏劑、片劑或膠囊制劑等，可用于制備預(yù)防和治療抗黃海希瓦氏菌感染的疾病的藥物、保健品，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治黃海希瓦氏菌引起的疾病的藥物或飼料添加劑。所述輔料及比例不予特別限定，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)添加劑或比例。
[0018]本發(fā)明的第四方面，提供上述所述的抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體在制備以黃海希瓦氏菌為抗原的親和純化試劑或以黃海希瓦氏菌為抗原的免疫檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。其中，所述以黃海希瓦氏菌為抗原的親和純化試劑中，抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體可以作為親和配基，用于相應(yīng)抗原的親和純化；所述以黃海希瓦氏菌為抗原的免疫檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，具體包括酶聯(lián)免疫吸附法、免疫沉淀、免疫電鏡、免疫印跡、抗體芯片、時(shí)間分辨熒光免疫分析和免疫細(xì)胞學(xué)等一系列免疫診斷技術(shù)中的應(yīng)用，用以檢測(cè)相應(yīng)的抗原。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明公開(kāi)了一種抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法，該方法制備得到的卵黃抗體純度較高，且對(duì)黃海希瓦氏菌有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)高免卵黃的獲取廉價(jià)、方便，便于低成本、大批量生產(chǎn)，其制備方法簡(jiǎn)便易行，最終獲得的高產(chǎn)、高效、較高純度的卵黃抗體可用于由黃海希瓦氏菌引起的疾病的預(yù)防和治療上及開(kāi)發(fā)黃海希瓦氏菌檢測(cè)試劑盒和進(jìn)行免疫學(xué)上的免疫反應(yīng)及診斷。本發(fā)明首次提出了抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體及其制備方法，填補(bǔ)了抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體相關(guān)研究的空白，并為以后的研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體效價(jià)隨免疫時(shí)間的變化結(jié)果；
[0021]圖2為檢測(cè)抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體純化效果的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果，其中，泳道1:蛋白Marker，泳道2:水溶性組分，泳道3:硫酸錢(qián)鹽析后的IgY，泳道4:硫酸鈉鹽析后的IgY，泳道5:超濾后獲得的IgY，泳道6 =IgY凍干粉，泳道7:標(biāo)準(zhǔn)IgY ;
[0022]圖3為抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體體外凝集趨勢(shì)圖，圖中顯示22h內(nèi)添加不同濃度特異性IgY與非特異IgY對(duì)黃海希瓦氏菌的凝集效果；
[0023]圖4為透射電鏡檢測(cè)抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體特異性結(jié)果，圖中顯示黃海希瓦氏菌與特異性IgY、非特異性IgY、不添加IgY共培養(yǎng)后與膠體金標(biāo)記兔抗雞IgG的孵育效果；
[0024]圖5為免疫熒光檢測(cè)抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體特異性結(jié)果，圖中顯示黃海希瓦氏菌與特異性IgY、非特異性IgY、不添加IgY共培養(yǎng)后與FITC標(biāo)記兔抗雞IgG的孵育效果。
【具體實(shí)施方式】
[0025]為了使本發(fā)明的目的、方案、流程和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明晰，結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，值得注意的是，此處具體實(shí)施例僅作為解釋說(shuō)明本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，所使用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從化學(xué)公司購(gòu)買(mǎi)。
[0026]實(shí)施例1
[0027]—種抗黃海希瓦氏菌卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟:
[0028](I)將保藏編號(hào)為 CGMCC N0.7303 的黃海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)接種于20ml 2216E液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)12h，復(fù)蘇菌體。菌體復(fù)蘇后，將100 μ L菌液接種到TSA固體瓊脂培養(yǎng)基，28 °C倒置培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種于2216E液體培養(yǎng)基中，在28°C，140rpm的條件下，搖床震蕩培養(yǎng)1h后，調(diào)節(jié)2216E液體培養(yǎng)基中的黃海希瓦氏菌菌量為3X 109CFU/mL。之后8000r/min，4°C條件下離心5min收集菌體。將收集的菌體用PBS重懸，8000r/min離心5min，棄上清，沉淀再用PBS重懸，這一過(guò)程重復(fù)三次。然后加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醛，37°C滅活24h，經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，即得到滅活的黃海希瓦氏菌抗原，放4°C冰箱備用；
[0029](2)將步驟(I)中的滅活黃海希瓦氏菌抗原與弗式完全佐劑(初免)或弗式不完全佐劑(二免和三免)等體積混合，并采用雙推法進(jìn)行乳化制備疫苗，疫苗4°C保存。并用PBS與弗式完全佐劑和弗式不完全佐劑等體積混合乳化制備非特異性疫苗作為對(duì)照。
[0030](3)免疫程序:40羽120日齡健康來(lái)杭蛋雞隨機(jī)分為兩組，一組用黃海希瓦氏菌疫苗免疫，