用于Bt Cry1類毒素廣譜檢測(cè)的抗體及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生化領(lǐng)域，特別是一種用于化化yl類毒素廣譜檢測(cè)的抗體及其制備 方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[000引 自1987年化Ider等首次報(bào)道研制成功轉(zhuǎn)蘇云金芽抱桿菌fAyrin知easis，Bt)毒素基因抗蟲植物W來，目前已有超過400個(gè)化毒素基因被克隆和測(cè) 序，能用作商業(yè)制劑或轉(zhuǎn)化化y家族基因作物已有十幾類(包括化ylAa，化ylAb，化ylAc， CrylB,CrylC，CrylD，CrylE，CrylF，Cry2Aa，Cry2Ab，Cry3A，Cry3B，Cry34,Cry35 等），轉(zhuǎn) Bt毒素基因抗蟲性作物不斷出現(xiàn)并得到大面積的推廣，產(chǎn)生了極其顯著的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生 態(tài)效益，但隨著轉(zhuǎn)化基因抗蟲植物的大規(guī)模推廣，其對(duì)生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)W及對(duì)人類和其它哺 乳動(dòng)物的安全隱患逐漸受到關(guān)注。目前，我國(guó)稻米中已多次被報(bào)道發(fā)現(xiàn)了化化y毒素基因 和毒素產(chǎn)物，并且已經(jīng)對(duì)我國(guó)稻米出口產(chǎn)生了嚴(yán)重不良影響，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的大力發(fā)展， 被應(yīng)用的化化y毒素基因種類愈來愈多，帶來的政府安全監(jiān)管和食品加工企業(yè)原料管控 的技術(shù)制約愈來愈明顯，尤其是當(dāng)針對(duì)一些轉(zhuǎn)基因食物中基因檢測(cè)不能取得滿意效果的時(shí) 候，對(duì)毒素表達(dá)產(chǎn)物安全篩查檢測(cè)尤為迫切。
[0003]目前針對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中毒素蛋白的檢測(cè)方法主要采用針對(duì)單一毒素的抗體檢測(cè) 技術(shù)，由于針對(duì)不同毒素需要制備相對(duì)應(yīng)的抗體，且抗體制備過程冗長(zhǎng)、成本高，不能滿足 廣譜篩查檢測(cè)的要求。因此，如何利用化化y毒素具有的相似=維構(gòu)象特點(diǎn)，開發(fā)基于共 性結(jié)構(gòu)的化化y毒素廣譜篩選免疫檢測(cè)技術(shù)是一項(xiàng)很有應(yīng)用價(jià)值的工作。
[0004] 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道大約90%的單克隆抗體針對(duì)具有共性結(jié)構(gòu)的抗原都存在一定的交 叉反應(yīng)，而針對(duì)某一種化毒素檢測(cè)的單、多克隆抗體或單鏈抗體對(duì)于其它同源性較高的毒 素也具有一定的交叉反應(yīng)，運(yùn)是基于不同的化y毒素雖然氨基酸序列上有較大差異，但其 =維結(jié)構(gòu)卻非常相似的原理，目前，針對(duì)化化yl類毒素檢測(cè)用廣譜抗體尚未見相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明通過小鼠免疫，獲得針對(duì)化化yl類毒素檢測(cè)用廣譜抗體， 本發(fā)明是運(yùn)樣實(shí)現(xiàn)的： 一種用于化化yl類毒素廣譜檢測(cè)的抗體，其特征在于，所述抗體是由保藏號(hào)為CCTCC NO:C2015145的雜交瘤細(xì)胞分泌產(chǎn)生的。
[0006] 一株保藏號(hào)為CCTCCN0:C2015145的雜交瘤細(xì)胞，其分泌的抗體用于化化yl類 毒素廣譜檢測(cè)。
[0007] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述雜交瘤細(xì)胞是運(yùn)樣獲得的： 1) 利用MBS法合成免疫原，即將等摩爾數(shù)的經(jīng)過脫鹽處理的KLH-N肥與氨基酸序列為 SEQIDNO. 2的多膚混合，4°C反應(yīng)化，然后置于PBS溶液中透析72h，獲得免疫原； 2) 將濃度為Img/ml的免疫原和弗式完全佐劑按體積比1:1比例混合，WlOOug/只的 劑量免疫小鼠；w后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫時(shí)用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全 佐劑與免疫原混合，第四次免疫結(jié)束后一周采血測(cè)效價(jià)，效價(jià)達(dá)到血清稀釋10000倍，〇〇45。 值大于1. 0時(shí)，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合；然后采用間接ELISA法篩選細(xì)胞培 養(yǎng)上清，選擇陽(yáng)性克隆雜交瘤細(xì)胞孔進(jìn)行亞克隆，并用有限稀釋法連續(xù)克隆化2-3次，即獲 得所述雜交瘤細(xì)胞。
[000引本發(fā)明所述抗體在化化yl類毒素廣譜檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0009] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述應(yīng)用，具體為： A) 將保藏號(hào)為CCTCCN0:C2015145的雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠體內(nèi)，W體內(nèi)誘生法制備 腹水，然后利用辛酸-硫酸錠法純化腹水，獲得濃度為25mg/ml的抗體，然后WPBS溶液將 抗體稀釋1000-16000倍； B) 將抗體包被于固相載體，4。C過夜；次日PBST洗板，加入3%的MPBS，200yL/孔， 37 °C解育化；PBST洗板，加入待檢測(cè)品，100yL/孔，解育比；加入酶標(biāo)抗體解育比；PBST 洗板，加底物TMB-過氧化氨脈，100yL/孔，37 °C解育15min后每孔加入50yL濃度為 2mol/LH2SO4,結(jié)束反應(yīng)；同時(shí)WPBS溶液作為陰性對(duì)照； C) 測(cè)定反應(yīng)液0〇45。值，若待檢測(cè)品與陰性對(duì)照的0D45。比值大于2. 1，則待檢測(cè)品種含 有化化yl類毒素。
[0010] 本發(fā)明根據(jù)CrylAa，CrylAb，CrylAc，CrylB，CrylC和CrylF的氨基酸序列，從一 級(jí)序列相似性分析、二級(jí)抗原性和親水性分析W及=維結(jié)構(gòu)分析，設(shè)計(jì)的抗原多膚SEQID NO. 2,將其與載體蛋白KLH進(jìn)行偶聯(lián)后，免疫Ba化/c小鼠，成功獲得了可分泌針對(duì)化化yl 類毒素檢測(cè)用廣譜單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株保藏號(hào)為CCTCCN0:C2015145; 實(shí)驗(yàn)表明，濃度為25mg/ml的該抗體稀釋16000倍后，對(duì)六種化化yl類毒素的OD45。值與 陰性孔（PBS溶液）的比值均遠(yuǎn)大于2. 1，可見其效價(jià)較高，且對(duì)化化yl類毒素具備廣譜性 檢測(cè)效果，彌補(bǔ)化化yl類毒素廣譜檢測(cè)領(lǐng)域的空白。
【附圖說明】
[0011] 圖1為選定膚段的氨基酸序列對(duì)比結(jié)果示意圖； 圖2為選定膚段的抗原性和親水性分析結(jié)果示意圖； 圖3為六種毒素的=維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行重疊的結(jié)果示意圖； 圖4為選定膚段的=維結(jié)構(gòu)示意圖； 圖5為單克隆抗體化ISA檢測(cè)結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 實(shí)施例中設(shè)及溶液的制備方法： (1) 飽和硫酸錠溶液： 在500mL蒸饋水中加入500g硫酸錠，加熱至完全溶解；室溫過夜，析出結(jié)晶任其留在瓶 中，臨用前取所需的量，用化0H調(diào)抑至7.8; (2) 醋酸緩沖液（0.06mol/L PH4.8): NaAc0. 29g，HAc0. 141血溶于去離子水，定容至100血，調(diào)抑值至4. 8。
[0013] (3)憐酸鹽緩沖液（PBS，pH7. 4): 化Cl8.Og，KCl0. 2g，胞2冊(cè)04 ? 12&0 2. 9g，KH2PO40. 2g，加蒸饋水定容至IL; (4) 洗涂液（PBST):含有 0. 05%Tween的PBS; (5) 封閉液（MPBS):含有3%脫脂奶粉的PBS; (6)巧樣酸鹽緩沖液（CPBS，底物緩沖液，P冊(cè).5): Ce&Os(巧樣酸）21g，胞2冊(cè)〇4 ? 12&0 71. 6g，加蒸饋水定容至1L; (7) 底物：10mg/mL的TMB和 25uL0. 65%&〇2溶于 9. 875血CPBS中，現(xiàn)配現(xiàn)用； (8) 四甲基聯(lián)苯胺（TMB)母液： 稱取lOmg四甲基聯(lián)苯胺溶于1血二甲基亞諷，4°C保存； (9) 終止液（2MH2SO4): 取11. 8血98%的濃硫酸（18M)溶于80血蒸饋水，冷卻后定容到100血； (10) 碳酸鹽緩沖液（CBS): 胞2〇)3 1. 59g;Na肥〇3 2. 93g，定容到 1L; 實(shí)施例中所設(shè)及試劑： 弗式完全佐劑和弗式不完全佐劑均購(gòu)于Sigma公司； 化ylAa和化ylB抗體購(gòu)自上海佑隆生物科技有限公司； 實(shí)施例中所設(shè)及的氨基酸序列： 沈QIDNO. 1:SFREWEADPTNPALREEMRI; 沈QIDNO. 2 :CSFREWEADPTNPALREEMRI。
[0014]實(shí)施例1審I恪單克隆抗體 (1) 在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到CrylAa，CrylAb，CrylAc，CrylB，CrylC和CrylF的氨 基酸序列； (2) 利用DNAMAN軟件將CrylAa，CrylAb，CrylAc，CrylB，CrylC和CrylF的氨基酸序列 進(jìn)行對(duì)比，找出相似性最高的若干多膚序列，選定膚段的氨基酸序列對(duì)比結(jié)果如圖1所示； (3) 利用DNAStar軟件找出C巧lAa，C巧lAb，C巧lAc，CrylB，C巧1C和CrylF中抗原性 和親水性較強(qiáng)的部分，膚段的抗原性和親水性分析結(jié)果如圖2所示； (4) 最后利用SWISS-M孤化網(wǎng)站構(gòu)建CrylAa，CrylAb，CrylAc，CrylB，CrylC和CrylF 六種毒素的=維結(jié)構(gòu)模型，用Swiss-P化Viewer4. 1. 0軟件對(duì)=維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行分析，找 出六種毒素=維結(jié)構(gòu)重疊的區(qū)域，六種毒素的=維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行重疊的結(jié)果如圖3所示； (5) 將一級(jí)序列相似性分析結(jié)果、二級(jí)抗原性和親水性分析結(jié)果W及=維結(jié)構(gòu)分析結(jié) 果進(jìn)行綜合比較，選擇序列相似性較高、抗原性和親水性較強(qiáng)、空間構(gòu)象相似的一個(gè)多膚片 段為最有可能產(chǎn)生廣譜性免疫效果的抗原多膚，做為免疫半抗原，該膚段=維結(jié)構(gòu)如圖4 所示，圖4中，A即為選定膚段，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示；將該序列交由南京金斯 瑞生物科技有限公司合成，為了與載體蛋白KLH偶聯(lián)，在膚鏈的一端添加切S殘基，合成膚 段序列如SEQIDNO. 2所示； (6) 免疫原制備，W血藍(lán)蛋白（KLH)為載體蛋白，采用MBS法合成免疫原，具體步驟如 下：稱取5mgKLH-NHz溶于1ml0.ImM的PBS中，然后加入終濃度為ImM的Sulf〇-MB，4°C 下反應(yīng)化；再過G25Se地adex凝膠過濾層析柱進(jìn)行脫鹽去除多余的交聯(lián)劑； 接著將脫鹽處理后的KLH-N&和等摩爾數(shù)的多膚SEQIDNO. 2混合，于4°C反應(yīng)化后， 然后在4°C溫度下，置于PBS溶液中透析72h，透析期間每隔9-1化換液一次，即獲得免疫 原，然后分裝，于-20°C凍存?zhèn)溆茫?(7)單克隆抗體的制備：利用步驟（6)獲得的免疫原免疫8周齡左右Ba化/c雌性小鼠 4只，首次免疫時(shí)，將濃度為Img/ml的免疫原和弗式完全佐劑按體積比1:1比例混合后，W 腹腔注射的方式免疫小鼠，免疫劑量為lOOug/只； W后每隔兩周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫時(shí)用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑與免 疫原混合，第四次免疫結(jié)束后一周采血測(cè)效價(jià)，效價(jià)達(dá)到理想值（即：血清稀釋10000倍且 〇〇45。值大于1.0)時(shí)，再按照常規(guī)雜交瘤融合技術(shù)(參見吳建祥等，"稻攝病菌單克隆抗體的 研制及其對(duì)附著胞形成的影晌"微生物學(xué)報(bào)，2000, 40化）：638-645)與小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，采用間接ELISA法篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清，選擇陽(yáng)性克隆雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行 亞克隆，并用有限稀釋法連續(xù)克隆2-3次，得到一株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0015] 間接ELISA法步驟如下： ① 包被：用包被液CBS將包被