免疫球蛋白融合蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及雜交人Fc和免疫球蛋白融合蛋白，在其中雜交人Fc連接到生物活性 分子。具體地，它設(shè)及雜交人Fc，其源于人免疫球蛋白G(IgG)亞類的組合或人I曲和IgG 的組合；W及融合蛋白，在其中運(yùn)種Fc經(jīng)共價鍵偶聯(lián)到生物活性分子。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 生物活性分子在治療上可W具有很大的優(yōu)勢。但是，它們作為治療劑可能具有缺 點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兙哂休^低的體內(nèi)穩(wěn)定性。它們具有較短的循環(huán)半衰期或血清半衰期，因?yàn)樗鼈?被活體內(nèi)各種酶消化。因此，一直期望提高生物活性分子的循環(huán)半衰期。
[0004] 已知：增加蛋白質(zhì)大小，通過阻止經(jīng)腎去除蛋白質(zhì)可W增加它的半衰期（Knauf 等，J.Biol.化em. 1988. 263 :15064-15070)。例如，已經(jīng)報道通過將活性蛋白偶聯(lián)到人白蛋 白可增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性化instler等，Pharm.Res. 1995. 12 :1883-1888)。但是，由于活性蛋 白至人白蛋白的偶聯(lián)只是略微增加它的滯留期，因此發(fā)展含有偶聯(lián)到人白蛋白的活性蛋白 的有效藥物制劑不是有效方法。
[0005] 其它報道的方法是調(diào)整蛋白質(zhì)的糖基化。在蛋白質(zhì)上增加糖基化和將唾液酸引入 蛋白質(zhì)可防止肝中蛋白質(zhì)的降解。但是，蛋白質(zhì)糖基化的增加也導(dǎo)致了蛋白質(zhì)活性的降低。 [000引為了穩(wěn)定蛋白質(zhì)和防止經(jīng)腎的清除，將蛋白質(zhì)連接到聚乙二醇（PEG)。共價連接到 PEG已經(jīng)被廣泛使用W遞送具有延長的半衰期的藥物值elgado等，1992. 9 :249-304)。但 是，已經(jīng)報道陽G連接到細(xì)胞因子或激素導(dǎo)致受體結(jié)合親和力的降低，原因在于該連接所 引起的位阻。
[0007] 最近，已經(jīng)研究和發(fā)展了使用免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig)制備的融合蛋 白。Ig是血液的主要成分。人Ig化umanIg，hlg)包括不同種類，例如1邑6、1邑1、1邑4、1曲和 I姐（Roitt等，"Immunology" 1989,GowerMedicalPublishing,London,U.K.;NewYork, N.Y.)。人IgGs可W進(jìn)一步分為各種亞型，其已知為人IgGlOiIgGl)、人IgG2GiIgG2)、人 IgG3〇iIgG3)和人IgG4〇iIgG4)。
[0008] 免疫球蛋白由四條多膚鏈組成，兩條重鏈和兩條輕鏈，它們經(jīng)過二硫鍵形成四聚 體。每條鏈由可變區(qū)和恒定區(qū)組成?；谕N型（isotypes)，重鏈的恒定區(qū)進(jìn)一步地分成 S個或四個區(qū)（CH1、C肥、C冊和CH4)?；贗g同種型，重鏈恒定區(qū)的Fc部分包括較合部、 C肥、C冊和/或CH4結(jié)構(gòu)域。
[0009] 關(guān)于血清半衰期，IgGl、IgG2和IgG4具有21天的長半衰期，而其它免疫球蛋白具 有小于一周的相對短的半衰期。融合到IgG的Fc部分的嵌合蛋白質(zhì)顯示增加的穩(wěn)定性和 增加的血清半衰期（Capon等，化化re1989. 337 :525-531)。生物活性蛋白已融合在CH1區(qū) 域的N-端、Fc區(qū)域的N-端或IgGC冊區(qū)域的C-端。
[0010] 在開始期，用細(xì)胞表面受體例如CD4(Capon等，化Uire1989. 337 :525-531)、 TNFR(Mohler等，J.Immunology1993. 151 :1548_1561)、CTLA4(Linsley等，J.Exp. Med. 1991. 173 :721-730)、CD86(Modon等，J.Immunology1996. 156 :1047-1054)的胞外結(jié) 構(gòu)域產(chǎn)生IgG融合蛋白。同時，存在幾種已融合到IgG結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞因子和生長激素。但 是，與用細(xì)胞表面受體的胞外結(jié)構(gòu)域的融合不同，與非融合細(xì)胞因子或生長因子相比，用可 溶性蛋白質(zhì)融合到IgG導(dǎo)致生物活性的降低。嵌合蛋白質(zhì)作為二聚體存在，其導(dǎo)致由于與 它們的祀分子類似受體的相互作用而的位阻，原因在于彼此靠得很近的兩種活性蛋白質(zhì)的 存在。因此，運(yùn)個問題應(yīng)該被克服W產(chǎn)生有效的融合蛋白。
[0011] Fc融合技術(shù)的其它限制是存在不期望的免疫反應(yīng)。免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu) 域同時具有效應(yīng)子功能例如抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒反應(yīng)（antibodydependent cell-mediatedc}ftotoxicity，ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒（complement-dependent 巧totoxicity，CDC)。運(yùn)種效應(yīng)子功能一般經(jīng)過Ig的Fc區(qū)域與在效應(yīng)細(xì)胞上FcRs的相互 作用或經(jīng)過補(bǔ)體結(jié)合取得。因此，應(yīng)該進(jìn)行Fc的效應(yīng)子功能的阻斷W減少不期望的反應(yīng)例 如細(xì)胞殺死、細(xì)胞因子釋放或炎癥。
[001引發(fā)明公開 技術(shù)問題
[0013] 總的說來，有對具有生物活性的最小損失和具有不期望的免疫反應(yīng)的最小風(fēng)險的 改良Fc融合蛋白的需求。
[0014] 技術(shù)方案
[0015]本發(fā)明提供雜交Fc(雜合Fc)，其源于人IgG亞類的組合或人I曲和IgG的組合。 當(dāng)雜交Fc連接到生物活性分子時，雜交Fc有效增加了生物活性分子的血清半衰期，W及當(dāng) 編碼Fc-多膚融合蛋白的核巧酸被表達(dá)時，增加了多膚的表達(dá)水平。
[0016] 本發(fā)明同時提供在其中雜交Fc連接到生物活性分子的雜交Fc融合多膚。該融合 蛋白有時稱為"生物活性分子-Fc融合蛋白"或簡稱為"融合蛋白"。該融合蛋白可W具有 Fc和生物活性分子之間的連接體。Fc可W在其N-端偶聯(lián)到生物活性分子的C-端。
[0017] 可通過如下步驟產(chǎn)生融合蛋白：構(gòu)建編碼和能夠表達(dá)融合蛋白的核巧酸；在宿主 細(xì)胞中表達(dá)它；和收獲融合蛋白?？蛇x地，該融合蛋白可W通過表達(dá)編碼Fc的核巧酸，并W 常規(guī)方式將它連接到生物活性分子而產(chǎn)生。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的多膚可W用下式表示：
[0019]N'-狂l)p-Y-Z2-Z3-Z4-C'
[0020] 其中N'是多膚的N-端和C'是多膚的C-端；
[002。Z1表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:11的90到98位置的氨基酸殘基的至 少C-端部分或在SEQIDNO: 14的90-98位置的氨基酸殘基的至少一部分；
[002引 Y表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:11的99至Ij113位置的氨基酸殘基的至 少C-端部分或在SEQIDNO: 14的99到162位置的氨基酸殘基的至少一部分；
[002引 Z2表示氨基酸序列，其包括在SEQIDNO:12的111到147位置的氨基酸殘基的 至少N-端部分或在SEQIDNO: 14的163到199位置的氨基酸殘基的至少一部分：
[0024]Z3表示氨基酸序列，其包括在沈QIDNO:11的118-223、沈QIDNO:12的 114-219、沈Q ID NO :24的165-270或沈Q ID NO : 13的115到220位置的氨基酸殘基的至 少C-端部分；
[00巧]Z4表示氨基酸序列，其包括在沈Q ID NO :11的224-330、沈Q ID NO :12的220-326、SEQ ID N0:24的271-377或沈Q ID N0:13的221-327位置的氨基酸殘基的至少 N-端部分化及
[0026] P是0或1的整數(shù)，
[0027] 其中Z2和Z3氨基酸殘基總數(shù)是在80和140之間，兩端數(shù)值包括在內(nèi)。
[0028] Z1可W是氨基酸序列，其包括來自于SEQIDNO: 11的90-98位置的氨基酸殘基 C-端側(cè)的5到9個連續(xù)氨基酸殘基，或者來自于SEQIDNO: 14的90-98位置的氨基酸殘 基C-端側(cè)的5-9個連續(xù)氨基酸殘基。在一些實(shí)施方式中，Z1可W是IgGlCH1結(jié)構(gòu)域（SEQ IDNO:11)或I曲CH1結(jié)構(gòu)域（SEQIDNO:14)的5、6、7、8或9個C-端氨基酸殘基。
[0029] 在另一個實(shí)施方式中，Z1是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO :11的90-98位置的 氨基酸殘基或SEQ ID N0:14的90-98位置的氨基酸殘基。Z1可W是由SEQ ID N0:11的 90-98的位置或SEQ ID NO : 14的90-98的位置5到9個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。Z1 也可W是由SEQ ID NO : 11的90到98氨基酸殘基或SEQ ID NO : 14的90到98的氨基酸殘 基組成的氨基酸序列。
[0030] Y可W是氨基酸序列，其包括來自于SEQ ID NO : 11的99到113位置的氨基酸殘 基的C-端側(cè)的5個或更多個、或10個或更多個連續(xù)氨基酸殘基，或來自于SEQ ID NO: 14 的99到162位置的氨基酸殘基C-端側(cè)的10個或更多個連續(xù)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方 式中，Y可W是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO :11的99到113位置的氨基酸殘基、SEQ ID NO : 14的158至IJ 162位置的氨基酸殘基、SEQ ID NO : 14的153至IJ 162位置的氨基酸殘基、 SEQ ID NO : 14的143到162位置的氨基酸殘基、SEQ ID NO : 14的133到162位置的氨基 酸殘基或SEQ ID NO : 14的99到162位置的氨基酸殘基。
[003。Z2可W是氨基酸序列，其包括來自于SEQIDNO:120iIgG。的111至Ij 147位置 的氨基酸殘基的N-端側(cè)的4到37個或6-30個連續(xù)氨基酸殘基，或來自于SEQIDNO: 14化1曲）的163到199位置的氨基酸殘基的N-端側(cè)的6-30個連續(xù)氨基酸殘基。在某些實(shí) 施方式中，Z2可W是人IgG2C肥結(jié)構(gòu)域的6個N-端氨基酸殘基或人I曲C肥結(jié)構(gòu)域的8 個N-端氨基酸殘基。
[0032]Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可W是80和140之間。在一個實(shí)施方式中，Z2和Z3 的氨基酸殘基總數(shù)可W是90和120之間，兩端數(shù)值包括在內(nèi)。在另一個實(shí)施方式中，Z2和 Z3的氨基酸殘基總數(shù)可W是105和115之間，兩端數(shù)值包括在內(nèi)。在一個實(shí)施方式中，Z2 和Z3的氨基酸殘基總數(shù)是108。在更一個實(shí)施方式中，Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)是109。 [003引 Z4可W是氨基酸序列，其包括來自于沈QIDNOaiQiIgGl)的224-330、沈QID NO:120iIgG2)的 220-326、沈QIDNO:240iIgG3)的 271-377 或沈QIDNO:130iIgG4)的 221到327位置的氨基酸殘基的90或更多個、或100或更多個連續(xù)氨基酸殘基。Z4可W是 沈QIDNO: 11 的 224-330、沈QIDNO:12 的 220-326、沈QIDNO:24 的 271-377 或沈QID NO: 13的221到327位置的氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0034] 根據(jù)實(shí)施方式，Z3-Z4是選自W下的氨基酸序列：a)由SEQ ID NO : 11的118到 223位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO :11的224到330位置的氨基酸殘基的 N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列，（ii)由SEQIDNO:12的114到219位置的氨基酸殘基 的C-端部分和SEQIDNO: 12的220至Ij326位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨 基酸序列，（iii)由SEQIDNO:24的165到270位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQID NO:24的271到377位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列，和（iv)由SEQ IDNO: 13的115到220位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQIDNO: 13的221至Ij327位 置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方式，多膚的氨基酸殘基總數(shù)是從154到288。
[0036] 在一個實(shí)施方式中，Y可W是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:11的99-113位置的 氨基酸殘基的至少一部分，P可W是0或1;Z2可W是氨基酸序列，其包括SEQIDN0:12的 111-147位置的氨基酸殘基的至少一部分；和Z3可W是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:11 的 118-223、沈QIDNO: 12 的 114-219、沈QIDNO:24 的 165-270 或沈QIDNO: 13 的 115 到220位置的氨基酸殘基的至少一部分。在運(yùn)個實(shí)施方式中，當(dāng)P是1時，Z1可W是氨基 酸序列，其包括SEQIDNO:11的90到98位置的氨基酸殘基的至少一部分。
[0037] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，Z3可W是沈QIDNO:11的118-223、沈QIDNO: 12的 114-219、沈QIDNO:24 的 165-270 或沈QIDNO: 13 的 115-220 位置的 73 到 106 個連續(xù)氨 基酸殘基，并且Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可W是11〇dZ2可W是SEQIDN0:12的111-116 位置的氨基酸殘基，和Z3可W是沈QIDNO: 11的120-223、沈QIDNO:12的116-219、沈Q IDNO:24的167-270或沈QIDNO: 13的118至IJ220位置的氨基酸序列。
[0038] 在另一個實(shí)施方式中，Y可W是氨基酸序列，其包括SEQIDNO:14的99到162位 置的氨基酸殘基的至少一部分，P可W是1或〇(零）；Z2可W是氨基酸序列，其包括SEQID NO:14的163-199位置的氨基酸殘基的至少一部分；和Z3可W是氨基酸序列，其包括SEQ IDNO:13的121到220位置的氨基酸殘基的至少一部分。在運(yùn)個實(shí)施方式中，當(dāng)P是1時， Z1可W氨基酸序列，其包括SEQIDNO:14的90到98位置的氨基酸殘基的至少一部分。
[0039] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，Y可W是SEQIDNO:14的99-162位置的氨基酸殘基的 C-端側(cè)的20個連續(xù)氨基酸殘基或更多個、30個連續(xù)氨基酸殘基或更多個、40個連續(xù)氨基酸 殘基或更多個、50個連續(xù)氨基酸殘基或更多個、或60個連續(xù)氨基酸殘基或更多個。Z2可W 是沈QIDNO: 14的163到170位置的氨基酸殘基，Z3可W包括沈QIDNO: 11的124-223、 沈QIDNO: 12 的 120-219、沈QIDNO:24 的 171-270 或沈QIDNO: 13 的 121-220 位置的氨 基酸殘基的C-端側(cè)的71-100個連續(xù)氨基酸殘基。Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可W是108。
[0040] 在一個實(shí)施方式中，多膚可W由選自沈QIDNO:1、沈QIDNO:2、沈QIDNO:3、 沈QIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:26 和沈QIDNO:27 的核巧酸序列 編碼。多膚是選自沈QIDNO:18、沈QIDNO:19、沈QIDNO:20、沈QIDNO:21、沈QID NO:22、沈QIDNO:23、沈QIDNO:28 和沈QIDNO:29 的氨基酸序列。
[0041] 在一個實(shí)施方式中，多膚在它的N-端與生物活性分子融合，與所述生物活性分子 的天然形式（native化rm)的循環(huán)半衰期比較，該生物活性分子顯示增加的循環(huán)半衰期。 該生物活性分子可W是多膚、蛋白質(zhì)或非膚（apeptide)。該生物活性分子可W是多膚、膚 或蛋白質(zhì)藥物。生物活性分子可W是可溶性蛋白質(zhì)，例如但不限于：激素、細(xì)胞因子、生長 因子、共刺激分子、激素受體、細(xì)胞因子受體、生長因子受體或短膚。該生物活性分子可W是 EP0或它的變體/片段、p40或它的變體/片段（例如，含有Asn303Gln置換的p40變體）、 G-CSF或它的變體/片段、TNF受體、GM-CSF、比-1、比-2、比-3、比-4、比-5、比-6、比-7、 比-8、比-10、比-10 受體、TGF-P、TGF-P 受體、比-17、比-17 受體、因子 VII、CX化-1UFSH、 人生長激素、骨形態(tài)生成蛋白-1 化onemo;rphogeneticprotein-l，BMP-1)、CTLA4、PD-1、 61^*-1、6動物纖維素化61曰〇611111；[]1)、0口6、1?酷1(、（1干擾素（；[]116計61'〇]1-曰1地曰）、6干 擾素（inte計eron-beta)或它們的變體/片段。該生物活性分子可W是分泌性蛋白，其可 W是成熟的形式。
[0042] 在一個實(shí)施方式中，提供產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1的多膚的方法，其中該方法包括W 下步驟：（i)將編碼所述多膚的DNA分子引入哺乳動物宿主細(xì)胞，（ii)將細(xì)胞在其培養(yǎng)基中 在所述多膚可W被表達(dá)的條件下生長；和（iii)收獲表達(dá)的多膚。哺乳動物宿主細(xì)胞可W 是C冊、COS或BHK細(xì)胞。
[0043] 在另一個實(shí)施方式中，提供W下方法：（i)減少自身免疫性疾病的癥狀、預(yù)防或治 療自身免疫性疾病，（ii)抑制移植排斥，或（iii)治療或預(yù)防內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克，其包括施 用治療有效量的W上所述多膚，其中該多膚融合到生物活性分子。
[0044] 在一個實(shí)施方式中，提供分離的核酸分子，其編碼根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的多膚。 多膚可W具有選自W下的氨基酸序列：SEQIDNO:18、沈QIDNO:19、沈QIDNO:20、沈Q IDN0:21、沈QIDN0:22、沈QIDN0:23、沈QIDN0:28 和沈QIDN0:29。核酸分子可W 具有W下序列中顯示的核巧酸序列：SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、沈QIDN0:3、沈QIDNO: 4、沈QIDNO:5、沈QIDNO:6、沈QIDNO:26或沈QIDNO:27。核酸分子可W進(jìn)一步地 包括信號序列或前導(dǎo)序列。