一株高效利用乳清產(chǎn)乙醇的釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及工業(yè)微生物的育種，尤其是一株既緩解半乳 糖代謝調(diào)控又提高了抗逆性的高效利用乳清的釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳清是指在制造干酪或干酪素時，分離出絮凝物后剩下的極稀薄的液體，是工業(yè) 生產(chǎn)干酪及干酪素的副產(chǎn)品，每生產(chǎn)It的干酪產(chǎn)生化乳清，含有牛奶中55%的營養(yǎng)，但是 由于乳清具有很高的B0D和C0D，所W對環(huán)境造成很大的負擔(dān)。目前，全球乳清產(chǎn)量約為16 億噸，而只有其中的50%得到處理，用于食品、飼料等方面，剩下的約8億噸沒有得到有效 利用，被排泄到自然界中，不但造成環(huán)境的污染，而且還造成該資源的巨大浪費。乳清中除 了含有20%乳品蛋白外，含量最多的是乳糖，約占乳清5%左右，是廣生局B0D和COD的主 要原因。
[0003] 如何利用乳清中的乳糖，從而減低乳清對環(huán)境的污染一直是乳制品行業(yè)關(guān)注的問 題。乳糖的利用主要有W下幾個方向：用于食品行業(yè)、用于飼料行業(yè)、用于醫(yī)藥行業(yè)。但是 隨著全球能源危機的加劇，W及世界糧食安全問題等因素，乳清成為新的生產(chǎn)燃料乙醇的 主要原料，也使得利用乳清生產(chǎn)燃料乙醇成為一個全新的熱點。
[0004] 目前國外利用乳清生產(chǎn)燃料乙醇已有40多年的歷史，所使用的菌種主要有克魯 維酵母和釀酒酵母。克魯維酵母雖然能夠利用乳清，但是該屬酵母酒精產(chǎn)率低，抗逆性差， 菌體生長量大，不適用于生產(chǎn)乙醇。釀酒酵母雖然是生產(chǎn)乙醇的最佳首選，但是野生型釀酒 酵母不能夠利用乳清為唯一碳源，所W如何改造釀酒酵母，使其可W發(fā)酵乳清產(chǎn)乙醇，一直 是科研人員的研究熱點。目前國外的解決方法主要分為W下幾種：一、是利用原生質(zhì)體融合 技術(shù)，對釀酒酵母及克魯維酵母進行融合，篩選既可W利用乳糖又能高效產(chǎn)乙醇的突變株； 二、是采用基因工程手段，把外源基因?qū)氲结劸平湍阁w內(nèi)，使得釀酒酵母具有分解乳糖的 能力，從而解決其不能利用乳清的問題。目前導(dǎo)入最多的外源基因為克魯維酵母的LAC4基 因（編碼乳清分解酶）和LAC12基因（編碼乳清通透酶）。但是上述兩種方法所構(gòu)建的菌 株均存在乳清利用緩慢、發(fā)酵周期長等問題。 陽0化]對于Lac+釀酒酵母工程菌株而言，乳清中的乳糖先要被分解成葡萄糖和半乳糖之 后才會再繼續(xù)代謝。而對于釀酒酵母來說，其在利用半乳糖和葡萄糖時存在巨大差異，運種 差異既包括半乳糖代謝自身的調(diào)控，也包括葡萄糖對半乳糖利用酶系的抑制，即葡萄糖阻 遏現(xiàn)象。半乳糖作為釀酒酵母的"替代碳源"，耗氧狀態(tài)下其代謝速率僅為葡萄糖代謝速率 的1/3。半乳糖需先經(jīng)過Leloir途徑代謝成6-憐酸葡萄糖后才能進入糖酵解途徑被酵母 利用。Leloir途徑所需酶由GAL基因編碼，釀酒酵母的GAL基因?qū)儆诘湫偷谋磉_調(diào)芐基 因。有四種基因產(chǎn)物參與了GAL基因系統(tǒng)的運種表達調(diào)節(jié)，它們分別是位于XVI染色體上 的GAL4基因編碼一種能結(jié)合上述五種基因的上游序列位點并激活運些基因轉(zhuǎn)錄的Gal4蛋 白；還有位于染色體XIII上的GAL80基因編碼的Gal80蛋白則能和Gal4蛋白直接結(jié)合，從 而抑制Gal4的轉(zhuǎn)錄激活功能；W及位于染色體IV上的GAL3基因編碼的Gal3蛋白可W在 半乳糖誘導(dǎo)信號的作用下同ATP、半乳糖發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)，產(chǎn)生的別構(gòu)效應(yīng)物同Gal80蛋白結(jié) 合，釋放Gal4蛋白，但是目前半乳糖產(chǎn)生誘導(dǎo)信號的作用機制還不清楚。除了上述S種調(diào) 控蛋白外，最近研究表明位于染色體XIV上的GAL6基因編碼的Gal6蛋白也屬于GAL調(diào)控 基因的一種，Gal6蛋白會影響GAL家族基因轉(zhuǎn)錄mRNA的穩(wěn)定性。
[0006] 除了GAL基因自身表達調(diào)節(jié)過程，其表達還受葡萄糖的抑制。在酵母菌中，許多基 因的表達受葡萄糖的控制和調(diào)節(jié)作用，葡萄糖的阻遏設(shè)及到很多因素，包括葡萄糖信號傳 輸、中間調(diào)節(jié)因子、特殊轉(zhuǎn)錄阻遏和激活蛋白等，Migl蛋白復(fù)合體和64心激活蛋白（Gal4) 之間的復(fù)雜作用被認(rèn)為是葡萄糖阻遏半乳糖代謝的主要步驟。
[0007] 在釀酒酵母中，中性海藻糖分解酶是由NT化和NT肥基因編碼，其中起主要作用的 是NTH1編碼的蛋白。而葡萄糖阻遏蛋白復(fù)合物是由S個蛋白組成的復(fù)合物，其中只有由 MIG1編碼的Migl蛋白同半乳糖利用所需酶基因結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄。而在半乳糖代謝調(diào)控 途徑中，起到負調(diào)控表達作用的調(diào)控蛋白共有兩個，分別為Gal80(由GAL80基因編碼）和 Gal6(由GAL6基因編碼）。
[0008] 鄒靜等化ac+釀酒酵母工程菌中GAL80基因敲除對乳清利用的影響》公開了構(gòu) 建一株可W高效利用乳清的釀酒酵母工程菌株，克隆了AY5的GAL80基因，構(gòu)建敲除質(zhì) 粒pUC-GABCUP。W該質(zhì)粒為模板PCR擴增同源重組片段GA-CUP1-GB，WLac+釀酒酵母 AY51024M為受體菌株，利用同源重組的方法敲除受體菌株中的GAL80基因，得到一株既解 除Gal80抑制又能利用乳清的菌株AY51024M-G。
[0009] 目前，國內(nèi)外還沒有在過表達LAC4和LAC12基因同時又解除半乳糖代謝調(diào)控的報 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一株能夠高效利用乳清生產(chǎn)燃料乙醇的乳清利用型釀酒酵 母工程菌株。
[0011] 本發(fā)明實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：
[0012] 本發(fā)明提供的乳清利用型釀酒酵母工程菌（Saccharomycescerevisiae)具體 為AY5MG，已于2015年8月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 (簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101)，保藏編號為CGMCCNo. 11223,分類命名：釀酒酵母Saccharomycescerevisiae。
[0013] 本發(fā)明所述釀酒酵母工程菌AY5MG在乳清濃度為120g/L(乳糖含量為53.Ig/L) 的培養(yǎng)基中生長發(fā)酵產(chǎn)乙醇，發(fā)酵周期為5地，乳清中乳糖利用率為98.7% ;無水乙醇對乳 糖得率為49. 7% (相當(dāng)于理論得率的92. 3% )。
[0014] 本發(fā)明所述乳清利用型釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法，是通過強啟動子PGK1分別 表達乳糖分解酶基因LAC4及乳糖通透酶基因LAC12,同時敲除MIGUNT化W及GAL6基因， 在緩解葡萄糖阻遏現(xiàn)象的同時消除釀酒酵母菌自身的半乳糖代謝調(diào)控，得到一株具有高耐 性的高效利用乳糖產(chǎn)乙醇釀酒酵母工程菌。
[0015] 本發(fā)明所述釀酒酵母工程菌株的構(gòu)建方法具體包括如下步驟：
[0016] 1)W釀酒酵母基因組為模版，將PCR擴增出的GAL6基因的上、下游片段GAL6A和 GAL她與PUC19質(zhì)粒連接得到質(zhì)粒PUC-G6AB;
[0017] 2)將來源于化p-c質(zhì)粒的銅抗性基因CUPl與PUC-G6AB連接，得到質(zhì)粒 PUC-G6AB-CUP1 ； 陽0化]如利用PCR擴增技術(shù)，W質(zhì)粒PUC-G6AB-CUP1為模板，擴增出GAL6基因的同源重 組片段 GAL6A-CUP1-GAL6B;
[0019] 4)采用醋酸裡轉(zhuǎn)化法將GAL6A-CUP1-GAL6B同源重組片段導(dǎo)入到釀酒酵母受體菌 株的a型和a型單倍體，得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株；所述受體菌株 是采用專利CN102604849B公開的方法通過強啟動子PGK1分別表達乳清分解酶基因LAC4 及乳清通透酶基因LAC12,同時敲除MIG1基因和NT化基因而獲得的基因工程菌。
[0020] 5)將純化后的釀酒酵母a型和a型重組單倍體進行融合，通過抗性平板和生抱實 驗篩選得到可W利用乳清的釀酒酵母工程菌（雙倍體）。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種專口用于鑒定所述的去除半乳糖代謝負調(diào)控子的驗證序列， 該基因序列是WG6A-U和G她-D為引物，W所述的利用乳清釀酒酵母工程菌株基因組為模 板，擴增片段測序為一特異性序列，如序列表1所示。
[0022] 可W利用G6A-U和G她-D擴增出的引物大小來判斷該基因是否被去除。
[0023] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果：
[0024] 本發(fā)明使菌株在原有利用乳清能力的基礎(chǔ)上，通過阻斷半乳糖代謝調(diào)控負阻遏元 件基因，獲得了一株去除半乳糖代謝調(diào)控、快速高效利用乳清產(chǎn)乙醇的釀酒酵母工程菌株 AY5MG。
[00巧]本發(fā)明所獲得的可W利用乳清的釀酒酵母工程菌SaccharomycescerevisiaeAY5MG(保藏號CGMCCNo.11223)與初始的釀酒酵母菌（受體菌AY-510B24MSaccharomyces cerevisiaeCGMCCNo.5843)相比，能夠更為快速的利用乳清，在乳清濃度為120g/L(乳 糖含量為53.Ig/L)的培養(yǎng)基中生長、發(fā)酵產(chǎn)乙醇；發(fā)酵周期為5地，乳清中乳糖利用率為 98. 7% ;無水乙醇對乳糖得率為49. 7% (相當(dāng)于理論得率的92. 3% );同時緩解了釀酒酵 母自身的半乳糖代謝調(diào)控，使乳清可W被快速利用，在含有19%(v/v)乙醇，或者發(fā)酵溫度 為39°C時可W正常發(fā)酵。本發(fā)明釀酒酵母工程菌對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般酒 廠的設(shè)備和條件均可使用，因而有廣泛的應(yīng)用前景，能為W乳清為原料生產(chǎn)燃料乙醇提供 可能。
【附圖說明】
[0026] 圖1 :質(zhì)粒PUC-G6AB-CUP1的構(gòu)建流程；
[0027] 圖2 :質(zhì)粒PUC-G6AB-CUP1的驗證電泳圖。
[0028] 圖3 :陽性重組釀酒酵母單倍體的驗證。
[0029] 圖4 :乳清利用型釀酒酵母工程菌的構(gòu)建路線圖。 W30]圖5:工程菌與親本在模擬乳清分解液中發(fā)酵情況比較，其中（A)為親本AY-510B24M，度）為工程菌AY5MG。
【具體實施方式】
[0031] 下面通過具體的實施方