—種用于人體肝細(xì)胞毒理試驗改良培養(yǎng)基的強(qiáng)化劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，特別是一種用于人體肝細(xì)胞毒理試驗改良培養(yǎng)基的強(qiáng)化劑。
【背景技術(shù)】
[0002]利用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來驗證化合物毒理學(xué)實驗測試目前為止最為高效和可行的方法。隨著生物技術(shù)在化合物毒理學(xué)安全評價應(yīng)用領(lǐng)域和市場需求量的不斷擴(kuò)大，提高動物細(xì)胞培養(yǎng)和毒理學(xué)試驗、延長維持時間以獲得可靠結(jié)果，成為優(yōu)化動物細(xì)胞培養(yǎng)過程和毒理學(xué)實驗的核心。
[0003]眾所周知，動物細(xì)胞培養(yǎng)及毒理學(xué)試驗的效果的經(jīng)濟(jì)性和效率起決定性作用的是培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的優(yōu)化是建立高效的動物細(xì)胞培養(yǎng)和毒理學(xué)試驗過程的核心環(huán)節(jié)。因此，根據(jù)細(xì)胞在生長、代謝和毒理學(xué)試驗表達(dá)過程中的營養(yǎng)需求，設(shè)計動物細(xì)胞培養(yǎng)基中營養(yǎng)物的成分、含量和配比是工作的重要內(nèi)容。
[0004]國內(nèi)外許多商業(yè)化的培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清或替代物組成，顯著影響細(xì)胞生長、代謝和毒理試驗現(xiàn)象表達(dá)這些培養(yǎng)基一般僅能確保細(xì)胞的穩(wěn)定傳代，并不能較好地支持細(xì)胞生長和毒理試驗效果的表達(dá)，因而阻礙了細(xì)胞毒理學(xué)實驗的普及和應(yīng)用。
[0005]市售的商業(yè)無血清培養(yǎng)基在血清替代方面多具有良好的表現(xiàn)，但在支持細(xì)胞培養(yǎng)和高效表達(dá)毒理學(xué)效果方面仍有諸多缺陷。因此，在進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)和毒理學(xué)實驗時，多數(shù)無血清培養(yǎng)基難以充分、平衡地向細(xì)胞提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基利用率很低，造成極大的浪費。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種提高培養(yǎng)基利用率的用于人體肝細(xì)胞毒理試驗改良培養(yǎng)基的強(qiáng)化劑，以強(qiáng)化和豐富細(xì)胞培養(yǎng)基中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，能有效促進(jìn)細(xì)胞在培養(yǎng)基中的生長和被試物加快進(jìn)入細(xì)胞液表達(dá)，延長活細(xì)胞維持時間。
[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的，一種用于人體肝細(xì)胞毒理試驗改良培養(yǎng)基的強(qiáng)化劑，其特點是:在雙蒸餾水中添加有葡萄糖和氨基酸，
其中每升雙蒸餾水中葡萄糖和氨基酸的添加量為:
葡萄糖320— 500克、 谷氨酞胺20— 80克、
天冬酞胺2 —10克、脯氨酸10 — 20克、
蘇氨酸20— 40克、絲氨酸2—6克、
組氨酸2—6克、賴氨酸8—15克、
半胱氨酸2— 5克、四甲基戊二酸0.1—0.5克、
α _酬戊二酸0.1一2克、2_疏基乙醇0.1一 1.0克。
[0008]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題還可以通過以下技術(shù)方案來進(jìn)一步實現(xiàn)，所述的雙蒸餾水為無熱源雙蒸餾水。
[0009]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題還可以通過以下技術(shù)方案來進(jìn)一步實現(xiàn)，每升雙蒸餾水中葡萄糖和氨基酸的含量為:
葡萄糖300克； 谷氨酞胺25克；
天冬酞胺2克； 脯氨酸6克；
蘇氨酸15克；絲氨酸2克；
組氨酸2克；賴氨酸20克；
半胱氨酸2克； 四甲基戊二酸.0.5克； α-酮戊二酸2克；2-巰基乙醇0.5克。
[0010]本發(fā)明提供一種用于人體肝細(xì)胞毒理試驗改良培養(yǎng)基的營養(yǎng)強(qiáng)化劑，以強(qiáng)化培養(yǎng)基中的重要營養(yǎng)物質(zhì)，提高細(xì)胞培養(yǎng)及其在毒理學(xué)試驗中表達(dá)效率。滿足動物細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞毒理學(xué)實驗的需要。所述營養(yǎng)物添加劑中含有葡萄糖以作為細(xì)胞獲取營養(yǎng)的主要碳源物質(zhì)，為細(xì)胞生長和毒理學(xué)表達(dá)提供必要的能量供給；含有的氨基酸以作為細(xì)胞合成自身蛋白和蛋白產(chǎn)物的重要元素，能決定細(xì)胞在培養(yǎng)過程中所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度以及細(xì)胞活性的維持時間。
[0011 ] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的強(qiáng)化劑添加到培養(yǎng)基中后能有效提高細(xì)胞在培養(yǎng)基中的活細(xì)胞密度，延長活細(xì)胞在培養(yǎng)基中的維持時間，延緩細(xì)胞的死亡；添加到培養(yǎng)基中后能有效提高動物細(xì)胞的毒理學(xué)評價效果穩(wěn)定性和可靠性；本發(fā)明組分明確，具有較強(qiáng)的通用性，能適用于多種動物細(xì)胞培養(yǎng)基；添加到培養(yǎng)基中后細(xì)胞在做毒理學(xué)暴露試驗時提高細(xì)胞染毒效率；本發(fā)明成分簡單，不含動物來源成分，產(chǎn)品品質(zhì)能保證；本發(fā)明成本較低，配制及使用方便，適于大規(guī)模使用。
【具體實施方式】
[0012]一種用于人體肝細(xì)胞毒理試驗改良培養(yǎng)基的強(qiáng)化劑，在雙蒸餾水中添加有葡萄糖和氨基酸，
其中每升雙蒸餾水中葡萄糖和氨基酸的添加量為:
葡萄糖320— 500克、 谷氨酞胺20— 80克、
天冬酞胺2 —10克、脯氨酸10 — 20克、
蘇氨酸20— 40克、絲氨酸2—6克、
組氨酸2—6克、賴氨酸8—15克、
半胱氨酸2— 5克、四甲基戊二酸0.1—0.5克、
α _酬戊二酸0.1一2克、2_疏基乙醇0.1一 1.0克。
[0013]所述的雙蒸餾水為無熱源雙蒸餾水。用于每升培養(yǎng)基的添加量為10mL。
[0014]動物細(xì)胞的培養(yǎng)基成分復(fù)雜，其中除了對細(xì)胞的存活起維持作用的血清替代物、維生素、無機(jī)鹽和微量元素之外，葡萄糖、氨基酸等主要營養(yǎng)物質(zhì)對細(xì)胞的生長、代謝和毒理試驗結(jié)果起著至關(guān)重要的作用。其中，葡萄糖是動物細(xì)胞最為重要的碳源和能源物質(zhì)，是細(xì)胞進(jìn)行糖酵解和TCA循環(huán)的重要底物。而氨基酸作為蛋白質(zhì)合成的重要元件，在動物細(xì)胞生長代謝和產(chǎn)物表達(dá)過程中起到了不可替代的作用。氨基酸是蛋白質(zhì)和多膚合成的前體，可合成細(xì)胞自身所需的結(jié)構(gòu)蛋白以及生化反應(yīng)中必不可少的生物酶，還直接參與抗體的生物合成，同時也是合成其他生物分子的代謝中間體，還可作為底物提供細(xì)胞生理活動所必需的能量，是細(xì)胞生長、代謝和產(chǎn)物生產(chǎn)的重要營養(yǎng)物質(zhì)。
[0015]研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸對細(xì)胞的生理、代謝狀態(tài)具有顯著影響。如1997年Buckland等人發(fā)現(xiàn)流加培養(yǎng)過程中一些必需氨基酸的缺乏會引起細(xì)胞凋亡；1998年Bavister等人發(fā)現(xiàn)氨基酸能作為一種緩沖劑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PH，從而緩解因氨濃度累積而造成的毒害作用；2002年deZengotita等人的研究證明甘氨酸和蘇氨酸能保護(hù)細(xì)胞免受培養(yǎng)環(huán)境中累積的二氧化碳和滲透壓的不利影響；隨著對氨基酸重要性認(rèn)識的深化，培養(yǎng)基氨基酸的強(qiáng)化越來越受到重視，通過合理添加氨基酸可提高細(xì)胞的生長。例如文獻(xiàn)中顯示1994年Bibila等人通過提高流加培養(yǎng)基中的氨基酸濃度使最終產(chǎn)物濃度比批培養(yǎng)提高了 7倍；2005年Kuwae等人通過提高培養(yǎng)基中谷氨酞胺的濃度使細(xì)胞的生產(chǎn)速率提高了 1.7倍；2010年Rustandi等人通過改變培養(yǎng)基中的氨基酸濃度使產(chǎn)物濃度提高至13克/升，細(xì)胞的比生產(chǎn)速率達(dá)到了 45皮克/細(xì)胞.天。
[0016]綜上所述，葡萄糖和氨基酸作為關(guān)鍵的營養(yǎng)物質(zhì)在動物細(xì)胞培養(yǎng)基中起著至關(guān)重要的作用。國內(nèi)外許多商業(yè)化的培養(yǎng)基一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清或替代物組成，顯著影響細(xì)胞生長、代謝和毒理試驗現(xiàn)象表達(dá)這些培養(yǎng)基一般僅能確保細(xì)胞的穩(wěn)定傳代，并不能較好地支持細(xì)胞生長和毒理試驗效果的表達(dá)，因而阻礙了細(xì)胞毒理學(xué)實驗的普及和應(yīng)用。
[0017]以下具體介紹本發(fā)明適于動物細(xì)胞細(xì)胞毒理實驗改良培養(yǎng)基強(qiáng)化劑的【具體實施方式】，提供I個實施例，但是，本發(fā)明的實施不限于以下的實施例。
[0018]實施例應(yīng)用于商業(yè)無血清培養(yǎng)基EX-CELL ? 302對已獲得的CHO細(xì)胞株采用本研究的動物細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞細(xì)胞毒理實驗改良培養(yǎng)基強(qiáng)化劑。其使用如下:
一種適于動物細(xì)胞細(xì)胞毒理實驗改良培養(yǎng)基強(qiáng)化劑，含有葡萄糖和氨基酸，在一升無熱源雙蒸餾水中葡萄糖和氨基酸的含量為(重量為克):
葡萄糖300 ; 谷氨酞胺25 ;
天冬酞胺2 ； 脯氨酸6 ；
蘇氨酸15 ;絲氨酸2 ;
組氨酸2 ；賴氨酸20 ；
半胱氨酸2; 四甲基戊二酸.0.5; α -酮戊二酸2 ； 2-巰基乙醇0.5 ；
將所述葡萄糖和氨基酸組分充分溶解于無熱源雙蒸餾水中，配制成所述的營養(yǎng)物添加劑。本發(fā)明適于動物細(xì)胞細(xì)胞毒理實驗改良培養(yǎng)基強(qiáng)化劑的配制可采用常規(guī)方法。
[0019]將所述適于動物細(xì)胞細(xì)胞毒理實驗改良培養(yǎng)基強(qiáng)化劑按每升培養(yǎng)基添加1mL添加至商業(yè)無血清培養(yǎng)基EX-CELL? 302 CHO中。
[0020]使用添加了上述營養(yǎng)物添加劑的培養(yǎng)基，將CHO細(xì)胞以3-4 X 15細(xì)胞/毫升的密度、大于95%的活性接種于50ml細(xì)胞培養(yǎng)管中，放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。同時，使用不添加上述營養(yǎng)物添加劑的的EX-CELL ? 302 CHO培養(yǎng)基，采用上述相同方法對CHO細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，作為對照組。
[0021]在不含本發(fā)明營養(yǎng)物添加劑的EX-CELL ?302 CHO培養(yǎng)基中，最大活細(xì)胞密度為24X 15細(xì)胞/毫升，細(xì)胞活性維持在90%以上的時間為193小時。
[0022]在添加本發(fā)明營養(yǎng)物添加劑的培養(yǎng)基中，最大活細(xì)胞密度達(dá)到36 X 15細(xì)胞/毫升，比未添加時提高了 50%，細(xì)胞活性維持在90%以上的時間為235小時，比未添加時提高了21.8%。
【主權(quán)項】
1.一種用于人體肝細(xì)胞毒理試驗改良培養(yǎng)基的強(qiáng)化劑，其特征在于:在雙蒸餾水中添加有葡萄糖和氨基酸， 其中每升雙蒸餾水中葡萄糖和氨基酸的添加量為: 葡萄糖320— 500克、 谷氨酞胺20— 80克、 天冬酞胺2 —10克、脯氨酸10 — 20克、 蘇氨酸20— 40克、絲氨酸2—6克、 組氨酸2—6克、賴氨酸8—15克、 半胱氨酸2— 5克、四甲基戊二酸0.1—0.5克、 α _酬戊二酸0.1一2克、2_疏基乙醇0.1一 1.0克。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于人體肝細(xì)胞毒理試驗改良培養(yǎng)基的強(qiáng)化劑，其特征在于:每升雙蒸餾水中葡萄糖和氨基酸的含量為: 葡萄糖300克； 谷氨酞胺25克； 天冬酞胺2克； 脯氨酸6克； 蘇氨酸15克；絲氨酸2克； 組氨酸2克；賴氨酸20克； 半胱氨酸2克； 四甲基戊二酸.0.5克； α-酮戊二酸2克；2-巰基乙醇0.5克。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于人體肝細(xì)胞毒理試驗改良培養(yǎng)基的強(qiáng)化劑，其特征在于:所述的雙蒸餾水為無熱源雙蒸餾水。
【專利摘要】一種用于人體肝細(xì)胞毒理試驗改良培養(yǎng)基的強(qiáng)化劑，在雙蒸餾水中添加有葡萄糖和谷氨酞胺、天冬酞胺、脯氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、組氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、四甲基戊二酸、α-酮戊二酸、2-巰基乙醇，以強(qiáng)化和豐富細(xì)胞培養(yǎng)基中的重要營養(yǎng)物質(zhì)。添加到培養(yǎng)基中后能有效提高細(xì)胞在培養(yǎng)基中的活細(xì)胞密度，延長活細(xì)胞在培養(yǎng)基中的維持時間，延緩細(xì)胞的死亡；能有效提高動物細(xì)胞的毒理學(xué)評價效果穩(wěn)定性和可靠性；本發(fā)明組分明確，具有較強(qiáng)的通用性，能適用于多種動物細(xì)胞培養(yǎng)基；本發(fā)明成分簡單，不含動物來源成分，產(chǎn)品品質(zhì)能保證；本發(fā)明成本較低，配制及使用方便，適于大規(guī)模使用。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105200006
【申請?zhí)枴緾N201510724116
【發(fā)明人】周翔, 陳進(jìn), 郭瑛, 錢亮亮, 祁燕凌, 王愛媛
【申請人】連云港市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年10月30日