從胎盤(pán)胎兒面絨毛膜中提取亞全能干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，涉及一種來(lái)源于胎盤(pán)胎兒面絨毛膜的亞全能干細(xì)胞的方法，還涉及一種從胎盤(pán)胎兒面絨毛膜中提取亞全能干細(xì)胞的方法，本發(fā)明進(jìn)一步涉及該亞全能干細(xì)胞的用途。所得的亞全能干細(xì)胞還可以進(jìn)一步地被擴(kuò)增。
【背景技術(shù)】
[0002]哺乳動(dòng)物生物體是由萬(wàn)億個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的。細(xì)胞是人體的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，由干細(xì)胞分化而來(lái)，因此干細(xì)胞是人體各種組織器官的起源細(xì)胞。干細(xì)胞具有自我復(fù)制和多向分化的特征。在正常生殖生理過(guò)程中，干細(xì)胞由受精卵分化而來(lái)。受精卵最初發(fā)育形成原始胚胎干細(xì)胞，后者具有形成完整個(gè)體的全部潛能。原始胚胎干細(xì)胞進(jìn)一步分化增殖形成囊胚樣結(jié)構(gòu)，其內(nèi)層細(xì)胞群的細(xì)胞也稱(chēng)胚胎干細(xì)胞。囊胚內(nèi)層的單個(gè)胚胎干細(xì)胞不能形成一個(gè)完整的個(gè)體，但具有形成人體各種組織的全能性。囊胚胚胎干細(xì)胞繼續(xù)分化發(fā)育，逐步形成胎兒各器官的功能執(zhí)行細(xì)胞，同時(shí)以不對(duì)稱(chēng)分裂增殖的模式在機(jī)體組織特別是造血組織，包括連接胎兒和母體的胎盤(pán)臍帶血、骨髓、外周血、肝和脾中保留有不同分化潛能的干細(xì)胞。在整個(gè)胎兒發(fā)育到成年這個(gè)漫長(zhǎng)而復(fù)雜的過(guò)程中，干細(xì)胞逐級(jí)喪失其全能性，形成亞全能干細(xì)胞(Pluripotent stem cell，PSC ;亦有稱(chēng)為 sub-totipotent stem cells)、多能干細(xì)胞(Multipotent stem cell)和專(zhuān)能干細(xì)胞(Specialized stem cell)，后者按分化功能分別稱(chēng)造血干細(xì)胞、血管干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞，等等。這些處于不同發(fā)育階段的干細(xì)胞在人體組織器官的發(fā)育生長(zhǎng)、損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著決定性的作用，因此干細(xì)胞可以用來(lái)新陳代謝、修復(fù)組織器官，使機(jī)體活力旺盛而保持健康狀況。
[0003]迄今為止，人們對(duì)造血干細(xì)胞等專(zhuān)能干細(xì)胞的了解和臨床使用比較深入，對(duì)胚胎干細(xì)胞的了解也有長(zhǎng)足的進(jìn)展，但對(duì)亞全能干細(xì)胞，即在發(fā)育階段及分化能力上與胚胎干細(xì)胞接近，表達(dá)胚胎干細(xì)胞的許多特征，又具備多能干細(xì)胞的許多生物學(xué)特征，移植到體內(nèi)不產(chǎn)生畸胎瘤，這樣一類(lèi)干細(xì)胞了解甚少。
[0004]但是，亞全能干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞范疇，避免了類(lèi)似胚胎干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)倫理問(wèn)題，其在臨床上具有廣闊現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用前景。因此，亞全能干細(xì)胞已經(jīng)成為干細(xì)胞研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0005]近年來(lái)研究表明，在成體胎盤(pán)組織中，富含著一種具有多向分化能力的亞全能干細(xì)胞。胎盤(pán)是哺乳動(dòng)物妊娠期間母子間交換物質(zhì)的過(guò)渡性器官，其生理功能已被廣泛研究，但是胎盤(pán)作為一種細(xì)胞資源，其研究還處在起步階段。也就是說(shuō)，上皮層的形成早于內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的發(fā)生，因此，胎盤(pán)亞全能細(xì)胞的分化能力強(qiáng)于其他起源于三個(gè)胚層的多能干細(xì)胞。根據(jù)已有的研究顯示，胎盤(pán)亞全能細(xì)胞可以向內(nèi)、中、外三個(gè)胚層的細(xì)胞進(jìn)行分化，例如，胎盤(pán)亞全能細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化成為心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、胰島細(xì)胞等等。此夕卜，多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，胎盤(pán)亞全能細(xì)胞可以有效治療肺纖維化、肝硬化、帕金森和多發(fā)性硬化等病癥。
[0006]胎盤(pán)亞全能干細(xì)胞是一種重要的細(xì)胞資源。因此人胎盤(pán)亞全能干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞范疇，避免了胚胎干細(xì)胞的倫理爭(zhēng)議，而且胎盤(pán)的獲取容易，不會(huì)對(duì)產(chǎn)婦造成二次傷害，具有非常廣闊的市場(chǎng)前景。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)已有諸多關(guān)于亞全能干細(xì)胞提取制備方法。例如，CN101748096B(200810240040.8)公開(kāi)了一種新的亞全能干細(xì)胞制劑生產(chǎn)工藝技術(shù)及其用途，該干細(xì)胞制劑特征是:從人胎盤(pán)或臍帶分離提?、?51+⑶31-SOX-2+的亞全能干細(xì)胞，在特定培養(yǎng)條件下貼壁生長(zhǎng)，傳代擴(kuò)增至20代仍然基因穩(wěn)定，注射至動(dòng)物體內(nèi)不產(chǎn)生畸胎瘤。這些亞全能干細(xì)胞高表達(dá)⑶151和胚胎干細(xì)胞標(biāo)志0ct4和Sox-2，以及間葉組織、神經(jīng)、血管、肝、肌組織細(xì)胞的一些特異性標(biāo)志，不表達(dá)⑶31、⑶34、⑶45、HLA-1I。在體外培養(yǎng)和動(dòng)物體內(nèi)向人體三個(gè)胚層的組織細(xì)胞分化，并能修復(fù)相應(yīng)組織的損傷，改善其功能。本發(fā)明建立了 PSC的組織分離和培養(yǎng)以及規(guī)?；苽涔に嚰夹g(shù)，制備出高純度注射制劑。該亞全能干細(xì)胞制劑的有益效果是在動(dòng)物和人體臨床試驗(yàn)中，對(duì)許多組織器官損傷或衰老導(dǎo)致的疾病有良好的療效，且無(wú)毒副作用，異體使用不產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。
[0008]CN102703380B (201210166714.0)公開(kāi)了一種亞全能干細(xì)胞，其來(lái)源于剪斷的人類(lèi)臍帶或胎盤(pán)，細(xì)胞標(biāo)志是⑶151+0CT4+⑶184-，其在培養(yǎng)容器中貼壁生長(zhǎng)，能向人體內(nèi)、中、外胚層組織分化。本發(fā)明也公開(kāi)了該亞全能干細(xì)胞的制備方法，及其用于制備治療細(xì)胞損傷或細(xì)胞衰老疾病的藥物中的用途，以及其用作基因治療藥物的載體細(xì)胞的用途。
[0009]CN103275926B(201310170574.9)公開(kāi)了一種從胎盤(pán)小葉組織中提取亞全能干細(xì)胞的方法，特點(diǎn)是包括胎盤(pán)預(yù)處理后，利用胎盤(pán)小葉組織制備細(xì)胞懸液，再利用細(xì)胞懸液制備得到亞全能干細(xì)胞分離液的步驟；然后將亞全能干細(xì)胞分離液進(jìn)行原代培養(yǎng)和二代培養(yǎng)，收集二代培養(yǎng)過(guò)程中完全脫落細(xì)胞即得到亞全能干細(xì)胞的步驟；最后進(jìn)行程序降溫凍存，將溫度降至-80?-90.(TC后取出凍存樣本，放入液氮儲(chǔ)存罐長(zhǎng)期保存即可，優(yōu)點(diǎn)是傳代能力可達(dá)20代，不僅具有向成骨、軟骨、脂肪和神經(jīng)細(xì)胞分化的能力，還具有向胰島細(xì)胞和表皮細(xì)胞分化的能力，亞全能干細(xì)胞均一、穩(wěn)定、生長(zhǎng)周期短，操作簡(jiǎn)單，成本低。
[0010]CN103966159AB (201410050051.5)公開(kāi)了一種人胎盤(pán)亞全能干細(xì)胞，其來(lái)源于剝離的人類(lèi)胎盤(pán)羊膜，針對(duì)羊膜的上皮層和間充質(zhì)層所含有的細(xì)胞特點(diǎn)，采用了逐步分離的方法，最大限度地減少了羊膜間充質(zhì)層細(xì)胞對(duì)胎盤(pán)亞全能細(xì)胞的污染，有效地提高了人胎盤(pán)亞全能細(xì)胞的干性。該方法具有成本低、應(yīng)用前景廣闊、可為臨床和研究提供大量干細(xì)胞資源的特點(diǎn)。本發(fā)明還提供了一種從胎盤(pán)羊膜制備人胎盤(pán)亞全能干細(xì)胞并建立干細(xì)胞庫(kù)的方法。
[0011]CN104152408A(201410400235.X)公開(kāi)了亞全能干細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟:組織的獲得，消毒處理，組織的分離、洗滌和剪碎，膠原酶消化，亞全能干細(xì)胞的獲得。本發(fā)明公開(kāi)了一種從臍帶、胎盤(pán)羊膜、絨毛膜或基蛻膜組織中分離亞全能干細(xì)胞的方法，獲得的亞全能干細(xì)胞均一、穩(wěn)定、生長(zhǎng)周期短。
[0012]然而，本領(lǐng)域仍然期待有新的提取制備亞全能干細(xì)胞的方法，并且期待這種方法具有優(yōu)異的效能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種新的提取制備亞全能干細(xì)胞的方法，并且期待這種方法具有優(yōu)異的效能。本發(fā)明另一目的在于提供一種亞全能干細(xì)胞。本發(fā)明的再一目的在于提供亞全能干細(xì)胞的用途。
[0014]為此，本發(fā)明第一方面提供了一種從胎盤(pán)胎兒面絨毛膜中提取亞全能干細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟:
[0015](I)從采集盒中取出胎盤(pán)于白瓷盤(pán)中，去除羊膜和瘀血后，使用生理鹽水反復(fù)沖洗胎盤(pán)表面，進(jìn)行消毒處理；
[0016](2)轉(zhuǎn)移至新白瓷盤(pán)中，剪取胎兒面絨毛膜于10mm玻璃皿中，盡量剔除表面殘留的胎盤(pán)小葉組織，剪碎至0.5?1.5_3左右的小塊；
[0017](3)使用300目篩網(wǎng)，用大量生理鹽水沖洗組織小塊，去除其中殘留的血細(xì)胞；
[0018](4)組織消化:使用I?2倍組織體積的混合酶(0.lmg/ml的I型膠原酶，0.1mg/ml的II型膠原酶，0.lmg/ml透明質(zhì)酸酶和0.05mg/ml中性蛋白酶)，在37度恒溫?fù)u床10rpm振蕩消化10?30min ；
[0019](5)消化結(jié)束后加適量FBS終止，300目濾網(wǎng)過(guò)濾，加大量生理鹽水沖洗濾渣，獲得盡量多的細(xì)胞；
[0020](6)濾液經(jīng) 1000 ?2000rpm(特別是 1500rpm)離心 5 ?15min(特別是 1min)后，棄上清，再加生理鹽水洗滌，1000?1500rpm(特別是1200rpm)離心2?1min (特別是5min)，得單核細(xì)胞；
[0021 ] (7)磁珠分選(0CT-4陽(yáng)性、Nanog陽(yáng)性和STR0-1陰性)，獲得目標(biāo)細(xì)胞。
[0022]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中還進(jìn)一步包括如下步驟:
[0023](71)對(duì)所得目標(biāo)細(xì)胞取樣，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(例如Sysmex)計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀(例如FC500)檢測(cè)其活性。
[0024]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中還進(jìn)一步包括如下步驟:
[0025](72)采用程序降溫儀凍存目標(biāo)細(xì)胞，儲(chǔ)備。
[0026]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中還進(jìn)一步包括如下擴(kuò)增步驟:
[0027](73)將目標(biāo)細(xì)胞接種至多個(gè)T25培養(yǎng)瓶(0.5?2 X 15細(xì)胞/瓶，特別是I X 10 5細(xì)胞/瓶)中，添加亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM-F12培養(yǎng)基+10%FBS+10ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子BFGF+10ng/mL人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，傳至Pl代后，收獲，凍存，儲(chǔ)備，任選地進(jìn)行流式鑒定。
[0028]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所用的生理鹽水是無(wú)菌的。
[0029]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(2)中將胎兒面絨毛膜剪碎至Imm3左右的小塊。
[0030]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(4)中使用1.5倍組織體積的混合酶。
[0031]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(4)中的混合酶中還包含0.01?0.03mol/L枸櫞酸。特別是包含0.02mol/L枸櫞酸。
[0032]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(4)中，在37度恒溫?fù)u床10rpm振蕩消化20mino
[0033]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(73)中，將亞全能干細(xì)胞接種到無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，并加入培養(yǎng)液，然后置于37°C、飽和濕度、C02體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)開(kāi)始原代培養(yǎng)3?4天后；將無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液和未貼壁的細(xì)胞倒掉，并重新加入相同體積的培養(yǎng)液，置于上述培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)直至無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞達(dá)到75?85%的融合度后，倒掉無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液；將濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液按20%培養(yǎng)液體積的添加量加入到無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37°C消化I?5分鐘后，將無(wú)菌培養(yǎng)液倒入無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)終止消化，拍打晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落，將完全脫落的細(xì)胞和培養(yǎng)液倒入離心管內(nèi)，于1000?2000rpm離心5?10分鐘，將離心所得的沉淀用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液混勻沉淀，收集培養(yǎng)過(guò)程中完全脫落細(xì)胞即得到經(jīng)擴(kuò)增的亞全能干細(xì)胞。
[0034]根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(72)和步驟(73)中所述的對(duì)亞全能干細(xì)胞進(jìn)行的凍存是照如下方法進(jìn)行的:
[0035]將