艾滋病感染者hla-a2特異性ctl細胞的體外培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及免疫治療領(lǐng)域中艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞的體外培養(yǎng)方 法及其專用培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 艾滋病是嚴重威脅人類生命健康的全球性疾病，盡管抗病毒治療的出現(xiàn)顯著降低 了艾滋病患者的發(fā)病率和死亡率，然而，抗病毒治療要求終身服藥，且需達到95%的依從 性，在醫(yī)療資源不發(fā)達國家和地區(qū)可謂是一項沉重的負擔。因此，尋找根治艾滋病的腳步從 未停止。
[0003] 過繼性細胞免疫治療自20世紀80年代開始，過繼性細胞免疫治療在臨床上的應 用迅速擴展。近年來，WT細胞為基礎(chǔ)的過繼性細胞免疫治療技術(shù)已廣泛用于惡性腫瘤及 腫瘤轉(zhuǎn)移患者的治療，具有較好的安全性和有效性。
[0004] 細胞毒性T細胞（巧totoxicT-lympho^te，CTL)為一種特異T細胞，?？诜置诟?種細胞因子參與免疫作用，對某些病毒、腫瘤細胞等抗原物質(zhì)具有殺傷作用，與自然細胞構(gòu) 成機體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線。它的作用特點：可連續(xù)殺傷祀細胞，具有高效性，抗 原特異性和自身MHC限制性。HIV特異性CD8+T細胞與HIV病毒載量下降直接相關(guān)，尤其是 急性感染期的后期，病毒載量迅速下降的過程中，CD8+T細胞起到最重要的作用，體外實驗 中經(jīng)IFN- 丫分泌實驗和tetramer染色可見HIV感染者的CD8巧細胞具有特異的抗病毒作 用。從精英控制者（elitecontroller)和自體免疫力能長期將病毒載量控制在調(diào)定點水 平的病人外周血獲得的細胞毒性T淋己細胞，在體外實驗中，不經(jīng)HIV抗原預先刺激，即可 高效識別和溶解其自體HIV感染后的CD4巧細胞。
[0005]CTL細胞免疫傳輸療法是利用自身靜脈血的淋己細胞，在體外通過祀細胞抗原和 淋己因子的誘導，分化擴增成具有強大殺傷力的CTL細胞，再經(jīng)靜脈回輸體內(nèi)，從而有效的 發(fā)揮免疫效應，達到清除病毒和殺傷腫瘤細胞的作用。CTL細胞療法主要應用于乙肝、丙肝 和腫瘤的治療。
[0006]CD3分子分布于成熟T淋己細胞表面，至少由丫、5、e、C和n5種多膚鏈 組成，與T細胞抗原受體非共價連接。CD3單克隆抗體可誘導CD3多膚和TCR共帽形成 (co-capping)，并誘導T淋己細胞活化。TCR識別外來抗原與自身WIC分子形成的復合物， CD3對于信號的傳遞具有重要作用。
[0007] CD8分子分布于部分T淋己細胞和胸腺細胞，是由a和P兩條多膚鏈組成的穿膜 糖蛋白。作為細胞與細胞間的附粘分子血1CI類抗原是CD8分子的配體，CD8分子與血1CI 類抗原結(jié)合可W穩(wěn)定血1CI類抗原限制的T細胞（主要是CTL)與帶有血1CI類抗原與抗原 復合物的祀細胞結(jié)合。CD8陽性細胞為抑制性T淋己細胞/殺傷性T淋己細胞（suppressor Tlympho巧te/c}ftotoxicTlympho巧te,Ts/Tc)。CD8分子在T細胞增殖和分化的信號轉(zhuǎn) 導中起重要作用。
[0008] 干擾素（IFN)是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細 胞表面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復制，其類型分為=類，a-(白細 胞）型、6-(成纖維細胞）型和T-(淋己細胞）型；同時還可增強自然殺傷細胞（NK細 胞）、巨隧細胞和T淋己細胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強抗病毒能力。干擾素是 一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細胞和淋己細胞產(chǎn)生的 細胞因子，它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長分化及調(diào)節(jié)免疫功能等多 種生物活性。
[0009] 人類白細胞抗原化umanleuko巧teantigen，HLA)是人類的主要組織相容性復合 體，位于6號染色體上，分為HLA-I類分子和HLA-II類分子，與人類的免疫系統(tǒng)功能密切相 關(guān)。研究認為抗原提呈細胞表面的HLA分子是影響HIV特異性CTL的關(guān)鍵因素，不同的HLA 分子與疾病進展顯著相關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何進行艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞的 體外擴增培養(yǎng)。
[0011] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性 CTL細胞的成套培養(yǎng)基。
[0012] 本發(fā)明所提供的體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞的成套培養(yǎng)基，由 成套使用的培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2組成；所述培養(yǎng)基1和所述培養(yǎng)基2均為哺乳動物細胞無 血清培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基1含有氨基酸序列分別如SEQIDNo. 1-SEQIDNo. 9所示的9種 多膚，所述培養(yǎng)基2含有白細胞介素2。
[0013] 上述成套培養(yǎng)基中，多膚1的氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示；多膚2的氨基酸序 列如SEQIDNo. 2所示；多膚3的氨基酸序列如SEQIDNo. 3所示；多膚4的氨基酸序列如 SEQIDNo. 4所示；多膚5的氨基酸序列如SEQIDNo. 5所示；多膚6的氨基酸序列如SEQ IDNo. 6所示；多膚7的氨基酸序列如SEQIDNo. 7所示；多膚8的氨基酸序列如SEQID No. 8所示；多膚9的氨基酸序列如SEQIDNo. 9所示。
[0014] 本發(fā)明所提供的體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞的成套培養(yǎng)基，分 為便于存放的膽存型培養(yǎng)基和由所述膽存型培養(yǎng)基和水配成的即用型培養(yǎng)基。
[0015] 上述成套培養(yǎng)基中的所述膽存型培養(yǎng)基可為：所述培養(yǎng)基1中所述9種多膚的含 量滿足所述9種多膚中的每種多膚的使用濃度均為2yg/mL;所述培養(yǎng)基2中白細胞介素2 的含量滿足白細胞介素2的使用濃度為500U/mL。
[0016] 上述成套培養(yǎng)基中的即用型培養(yǎng)基可為：所述培養(yǎng)基1中所述9種多膚的每種多 膚的含量均為2yg/mL;所述培養(yǎng)基2中白細胞介素2的含量為500U/mL。
[0017] 上述成套培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基1是在MD-CM-STM-N培養(yǎng)基中添加所述9種多膚 得到的液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基2是在IMSF100培養(yǎng)基中添加白細胞介素2得到的液體培 養(yǎng)基。
[0018] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL 細胞的產(chǎn)品。
[0019] 本發(fā)明所提供的體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞的產(chǎn)品，包括上述 成套培養(yǎng)基和HLA-A2陽性的艾滋病感染者的離體的外周血單個核細胞。
[0020] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述A1或A2的制備方法：
[0021]A1、上述成套培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：分別制備所述培養(yǎng)基1和所述培 養(yǎng)基2,再將所述培養(yǎng)基1和所述培養(yǎng)基2分別進行獨立包裝，得到所述成套培養(yǎng)基；
[0022] A2、上述產(chǎn)品的制備方法，包括如下步驟：將上述成套培養(yǎng)基和所述HLA-A2陽性 的艾滋病感染者的離體的外周血單個核細胞分別進行單獨包裝，得到所述產(chǎn)品。
[0023] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL 細胞的組合物。
[0024] 本發(fā)明所提供的體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞的組合物，由SEQ IDNo. 1-SEQIDNo. 9所示的9種多膚組成，所述組合物中所述沈QIDNo. 1-SEQIDNo. 9 所示的9種多膚的質(zhì)量比為1:1:1:1:1:1:1:1:1。
[00巧]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞的成套試劑。
[0026] 本發(fā)明所提供的體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞的成套試劑，由上 述組合物和白細胞介素2組成，所述組合物和白細胞介素2配套使用。
[0027] 上述成套試劑中，所述組合物中的所述多膚1、所述多膚2、所述多膚3、所述多膚 4、所述多膚5、所述多膚6、所述多膚7、所述多膚8、所述多膚9和白細胞介素2的配套使用 可滿足如下比例2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：（4000U-5500U)， S斗本胃S2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：2y邑：2y邑=400011頁!^ 2y邑：2y邑： 2]i邑：2]i邑：2]i邑：2]i邑：2]i邑：2]i邑：2]i邑=550011。
[002引本申請中所述艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞為HLA-A2陽性的艾滋病感染 者的離體的CD3+CD8巧淋己細胞。
[0029] 本發(fā)明還提供了下述1)-7)中任一種應用：
[0030] 1)所述成套培養(yǎng)基在制備體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞產(chǎn)品中 的應用；
[0031] 2)所述成套培養(yǎng)基在體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞中的應用；
[0032] 3)所述產(chǎn)品在體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞中的應用；
[0033] 4)所述組合物在制備體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞產(chǎn)品中的應 用；
[0034] 5)所述組合物在體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞中的應用；
[0035] 6)所述成套試劑在制備體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞產(chǎn)品中的 應用；
[0036] 7)所述成套試劑在體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞中的應用。
[0037] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL 細胞的方法。
[0038] 本發(fā)明所提供的體外擴增艾滋病感染者HLA-A2特異性CTL細胞的方法，包括如下 步驟：將HLA-A2陽性的艾滋病感染者的離體的外周血單個核細胞和所述培養(yǎng)基1混合后， 培養(yǎng)2天后，加入與所述培養(yǎng)基1體積相同的所述培養(yǎng)基2,W后每3-4天加入是所述培養(yǎng) 基1體積1. 5倍的所述培養(yǎng)基2培養(yǎng)，從第一次加入所述培養(yǎng)基2起，再培養(yǎng)10-16天，完 成艾滋病感染者HLA-A2