一種利用整合宿主因子來提高基于pcr的基因合成技術(shù)靈敏度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是設(shè)及一種基于PCR的基因合成技術(shù)為基礎(chǔ)的核酸分子合成和擴增技術(shù) 的方法，主要設(shè)及一種耐熱的，與DNA雙鏈結(jié)合的整合宿主因子來提高基于PCR的基因合成 技術(shù)靈敏度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] -步到位PCR基因合成又稱一步到位重疊延伸PCR，是一種簡單快速的基因 合成方 '法一Simplifiedgenesynthesis:曰one-stepapproachtoPCR-b曰sedgene construction是由Wu博± 2006年提出的，具體的步驟如下：設(shè)計需要合成DNA序列的重 疊寡核巧酸大約50bp，每個序列之間都有大約25bp的重疊寡核巧酸，W覆蓋整個DNA序列 (200到1500堿基），將含有脫氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W及作為模板的 上述的混合重疊寡核巧酸的反應(yīng)液中加入IHF，按照常規(guī)PCR的解鏈，退火，延伸S個步驟 進行反復(fù)的循環(huán)，從而將目的核酸片段合成并且擴增。
[0003] 體外DNA合成技術(shù)是合成生物學(xué)最基礎(chǔ)、最有力的工具，可W突破傳統(tǒng)克隆技術(shù) 的局限，實現(xiàn)從頭合成、按需合成和生物大分子的定向改造?；赑CR的基因合成又稱重疊 延伸PCR，是一種簡單快速的基因合成方法，重疊延伸PCR使用長約50bp、互相重疊約25bp 的寡核巧酸引物，通過一步簡單的重疊延伸PCR，然后用最外端的兩條引物進行擴增就可W 得到完整的基因。此技術(shù)利用PCR能夠在體外進行有效的基因重組，具有廣泛而獨特的應(yīng) 用價值。
[0004] 整合宿主因子（IH巧是調(diào)控原核生物基因復(fù)制轉(zhuǎn)錄的蛋白之一，它是一種熱穩(wěn)定 的DNA結(jié)合蛋白，能與DNA結(jié)構(gòu)中的小槽處相互作用使之發(fā)生結(jié)構(gòu)改變從而達到調(diào)控基因 的表達轉(zhuǎn)錄等作用，IHF由a亞基和P亞基兩個異源亞基構(gòu)成，a亞基和P亞基之間有 30%的同源性.已有研究報道單獨表達的1邸-〇亞基難與〇臟結(jié)合，而1邸-6亞基可與 DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。
[0005]IHFP的DNA序列與文獻報道度onnefoyE等，EMB0J，10(3) :687-696， 1991) 一致GenBank:LM995446. 1 其序列為ATGACCMGTCAGAA1TGAT
[0006] 在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)液的組成及熱循環(huán)反應(yīng)條件的優(yōu)化是決定反應(yīng)成敗的關(guān)鍵， 對于重疊延伸PCR反應(yīng)而言更是如此。為了最大限度地避免堿基的錯配，重疊延伸PCR反 應(yīng)一般采用高保真DNA聚合酶。傳統(tǒng)的高保真DNA聚合酶雖具有較好的校正能力，但其擴 增效率一直難W令人滿意。雖然一些既具有校正功能又具有很強延伸能力的DNA聚合酶已 陸續(xù)被開發(fā)應(yīng)用，但是效果也仍需加強。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用整合宿主因子來提高基于PCR的基因合成技術(shù) 靈敏度的方法，并且能夠有效地提高合成和擴增目標(biāo)核酸序列的靈敏度。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] 一種利用整合宿主因子來提高基于PCR的基因合成技術(shù)靈敏度的方法，通過如下 步驟實現(xiàn)：
[0010] S1 :設(shè)計需要合成的DNA序列，得到混合重疊寡核巧酸；其中，每個序列都有25bp 的重疊寡核巧酸，W覆蓋整個DM序列（200到1500堿基）；
[0011] S2 :將含有脫氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W及作為模板的上述混 合重疊寡核巧酸的反應(yīng)液中加入IHF原液；其中，IHF原液的濃度為10化g/y1 ;
[0012] S3:按照常規(guī)PCR的解鏈，退火，延伸S個步驟進行反復(fù)的循環(huán)，將目的核酸片段 合成并且擴增。
[0013] 采用上述方案后，本發(fā)明中將含有脫氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W 及作為模板的混合重疊寡核巧酸的反應(yīng)液中加入IHF原液，按照常規(guī)PCR的解鏈，退火，延 伸=個步驟進行反復(fù)的循環(huán)，從而將目的核酸片段合成并且擴增。本發(fā)明方法能夠特異性 地、高效地合成和擴增目標(biāo)核酸序列。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明中整合宿主因子活性電泳檢測圖；
[001引圖2為本發(fā)明中整合宿主因子對PCR合成影響的電泳檢測圖；
[0016] 圖3為本發(fā)明中合成產(chǎn)物光密度值結(jié)果圖；
[0017] 圖4為本發(fā)明中IHF0SDS-PAGE電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0018] IHF-P對基于PCR的基因合成效率的影響：
[0019] 將不同濃度的IHF-P蛋白加入到相同量的祀T-22b質(zhì)粒中，室溫放置lOmin后用 1% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)由加入低濃度蛋白到高濃度蛋白后，pET-2化質(zhì)粒的 條帶發(fā)生了明顯的移動，結(jié)果如圖1所示。圖1中：
[0020] 1 :質(zhì)?？瘢┡cshiftbuffer(SB)混合液；
[0021] 2 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入0. 5y1IHF;
[002引 3 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入liilIHF;
[002引 4 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入2y1IHF;
[0024] 5 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入4ylIHF;
[002引 6 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入6ylIHF;
[002引 7 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入8y1IHF;
[0027] 8 :Z與SB混合液體系內(nèi)加入9ylIHF。
[002引為了探索IHF-0對基于PCR的基因合成效率的影響，我們使用PCR對IHF-0蛋 白基因進行合成，在分別加入了不同濃度的IHF-P蛋白后，合成產(chǎn)物經(jīng)1% (W/V)瓊脂糖 凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)加了IHF-P蛋白的PCR合成產(chǎn)物中目的片段的產(chǎn)量與沒加的相比有如 下變化：在一定濃度的IHF-P蛋白下合成效率有較顯著的增強，濃度達到一定值后合成效 率反而變小，結(jié)果如圖2所示。而且我們對合成產(chǎn)物的光密度值進行了測定，結(jié)果如圖3所 /J、- 0
[0029] 本發(fā)明一種利用整合宿主因子來提高基于PCR的基因合成技術(shù)靈敏度的方法，通 過如下步驟實現(xiàn)：
[0030]S1 :設(shè)計需要合成的DNA序列，得到混合重疊寡核巧酸；其中，每個序列都有25bp 的重疊寡核巧酸，W覆蓋整個DM序列（200到1500堿基）；
[003。S2 :將含有脫氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核巧酸引物，W及作為模板的上述混 合重疊寡核巧酸的反應(yīng)液中加入IHF;其中，IHF原液的濃度10化g/y1;
[0032]S3 :按照常規(guī)PCR的解鏈，退火，延伸S個步驟進行反復(fù)的循環(huán)，將目的核酸片段 合成并且擴增。
[0033] 上述混合重疊寡核巧酸（所有的重疊寡核巧酸鏈）由LifeTechnologies公司合 成。
[0034] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于所述內(nèi) 容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。
[0035] 實施例1 :
[0036] 本發(fā)明中，寡核巧酸引物設(shè)計過程如下：
[0037] 1、使用的軟件：GenSearch
[0038] 2、GenSearch輸出的結(jié)果見下表：
[0039] 設(shè)計出的IHFgene的合成引物見表1:
[0040]
[0041]
[0042]表1
[004引實施例2 :IHF的制備
[0044] ①將來源于大腸桿菌的IHFa或IHFP亞基分別插入陽T2化表達載體中，通過 連接轉(zhuǎn)化并用菌落PCR、酶切鑒定及測序驗證，即可得到重組表達載體陽T22-IHFa或者 PET22-IHFP；
[0045] ②將構(gòu)建好的重組載體祀T22-IHFa或者祀T22-IHFP轉(zhuǎn)化大腸桿菌化21，取含 重組質(zhì)粒的陽性菌株加入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，之后菌液按體積比1%接種到50ml的 LB培養(yǎng)液中，放入37°C搖床培養(yǎng)至其0D值為0. 6-0. 8 ;加入IPTG，將菌液放入37°C搖床中 誘導(dǎo)表達3小時，搖床轉(zhuǎn)速為16化pm;
[0046] ③取誘導(dǎo)表達后的菌液離屯、得到菌體，裂解，釋放蛋白質(zhì)。SDS-PAGE電泳檢測蛋白 表達情況。結(jié)果如圖4所示。
[0047] ④IHF的純化
[0048] 利用上述操作②與③的操作大量培養(yǎng)含重組質(zhì)粒的陽性菌株。菌液經(jīng)離屯、 (3000Xg) 15min，收集大腸桿菌菌體，-70°C冷凍放置過夜。
[0049] 菌體懸浮在裂解緩沖液（組分為：0.1M，0.02M邸TA和0.2mg/ml蛋清溶菌酶）（pH 7. 5)，30min。冰上超聲裂解菌體，裂解液離屯、（120000Xg)90min。上清液W陰離子交換柱 PrepQ純化。W25mMTris/肥1，ImM邸TA(pH7.W沖洗，再W化C1梯度洗脫。之后，W肝 素親和柱純化，W化C1梯度洗脫，得到純度為95%左右的IHF蛋白原液。經(jīng)測定IHF蛋白 原液的濃度為10化g/y1。
[0050] 經(jīng)檢測，本實驗獲得的IHFP的DM序列與文獻報道度onne化yE等，EMBOJ， 10(3) :687-696,，1991) 一致；GenBank:LM995446. 1 其序列如序列表中沈QIDNO. 1 所示。 [00川⑥IHF的活性檢測
[0052] 按照表2配置10y1的反應(yīng)體系
[0053]
[0054]表 2
[005引如表2所示，在反應(yīng)液中，加入不同體積的實施例2得到的IHF蛋白（濃度相同）， 室溫下靜置lOmin。之后分別取5 反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果見圖3?？梢?在加入IHF蛋白后，IHF與雙鏈DNA結(jié)合，隨著加入量的增加，DNA條帶逐漸上移。表明純化 出的蛋白IHF有活性并且與環(huán)狀的雙鏈DNA相互作用。
[0056] 實施例3 :整合宿主因子對PCR合成的影響
[0057] 設(shè)計好的寡核巧酸鏈由LifeTechnologies公司合成。訂購的各寡核巧酸鏈分別 用lOmMTris-肥1(抑8.W溶解至lOOiiM濃度，再將所有的寡核巧酸鏈混合并用蒸饋水稀 釋至得到1yM濃度的寡核巧酸鏈混合液，在PCR反應(yīng)體系中加入此寡核巧酸鏈混合液作模 板，并至所有的寡核巧酸鏈的終濃度為25nM。
[005引 按表3配制PCR反應(yīng)液20y1。
[0059]
[0060]表 3
[0061] 在分別加入不同體積的實施例2得到的IHF蛋白（濃度相同）后，合成產(chǎn)物經(jīng)1% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)加了IHF-P蛋白的PCR合成產(chǎn)物中目的片段的產(chǎn)量與沒 加的相比有如下變化：在一定濃度的IHF-P蛋白下合成效率有較顯著的增強，濃度達到一 定值后合成效率反而變小，結(jié)果見圖4。
【主權(quán)項】
1. 一種利用整合宿主因子來提高基于PCR的基因合成技術(shù)靈敏度的方法，其特征在 于：通過如下步驟實現(xiàn)： 51 :設(shè)計需要合成的DNA序列，得到混合重疊寡核苷酸；其中，每個序列都有25bp的重 疊寡核苷酸，以覆蓋整個DNA序列（200到1500堿基）； 52 :將含有脫氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作為模板的上述混合重 疊寡核苷酸的反應(yīng)液中加入IHF原液；其中，IHF原液的濃度為102ng/y1 ; 53 :按照常規(guī)PCR的解鏈，退火，延伸三個步驟進行反復(fù)的循環(huán)，將目的核酸片段合成 并且擴增。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用整合宿主因子來提高基于PCR的基因合成技術(shù)靈敏度的方法，其將含有脫氧核糖核甘酸，DNA聚合酶，寡核苷酸引物，以及作為模板的混合重疊寡核苷酸的反應(yīng)液中加入IHF原液，按照常規(guī)PCR的解鏈，退火，延伸三個步驟進行反復(fù)的循環(huán)，從而將目的核酸片段合成并且擴增。本發(fā)明方法能夠特異性地、高效地合成和擴增目標(biāo)核酸序列。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105200036
【申請?zhí)枴緾N201510602375
【發(fā)明人】戚智青, 唐黎, 侯丹, 齊曉雪, 張秀英, 刁勇, 王慶波, 潘海波, 高宏志, 劉楠辛
【申請人】華僑大學(xué)
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月21日