OsFBH1轉錄因子在調控抽穗期方面的應用
【專利說明】OsFBHI轉錄因子在調控抽穗期方面的應用
[0001] 本研究得到國家自然科學基金項目（No. 31171515)及天津市中青年骨干教師 創(chuàng)新培養(yǎng)計劃（No.ZX110GG017)的資助。
技術領域
[0002] 本發(fā)明設及水稻化功能研究技術領域，更確切地說是化轉錄因子在水 稻抽穗期方面。
【背景技術】
[0003] bHLH(Basic/helix-loop-helix)轉錄因子是植物中的轉錄因子大家族，bHLH轉 錄因子得名來源于其蛋白結構能形成bHLH結構域。該結構域一般含有60個氨基酸，按照 一定順序排列后能夠形成一個堿性氨基酸區(qū)(約15個氨基酸)和一個a-螺旋-環(huán)-a-螺 旋區(qū)（HLH區(qū)，約40個氨基酸）。其中堿性區(qū)域位于bHLH結構域的N端，其作用主要同 DNA結合區(qū)結合相關，例如，某些氨基酸能夠對祀基因啟動子區(qū)域的E-box巧'-CANNTG-3') 特異性識別并與之結合；HLH區(qū)同堿性區(qū)域相連，位于bHLH結構域的C端，不同長度的連 接環(huán)將兩個a-螺旋連接起，形成了HLH區(qū)域。還有些轉錄因子之間能夠形成同源或異源 性二聚體，進而調控基因的表達。
[0004] bHLH廣泛存在于高等植物，調控很多生理代謝過程。在植物的生長發(fā)育、脅迫應 答、次生代謝及植物的開花調控中起重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，bHLH類型轉錄因子能夠 同光敏色素基因互作從而調控植物開花。擬南芥中，bHLH轉錄因子能夠調控a堪因的表 達，從而促進擬南芥的開花。為了進一步探究該轉錄因子家族在水稻抽穗開花中所起的作 用W及在光周期通路中的作用機制，本發(fā)明利用反向遺傳學方法對水稻化巧?似的功能進 行了研究，結果表明化巧?似定位于細胞核中，是一個核蛋白，主要在葉片中大量表達，可W 調控水稻的抽穗期早晚。水稻抽穗開花期是水稻產量的重要構成要素之一，對水稻產量有 重要影響；同時水稻抽穗開花的早晚常伴隨著水稻巧粒產量的變化，因此清晰的掲示水稻 成花的分子調控通路，利用分子設計輔助育種，對于提高水稻產量具有廣闊的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供OsFBHI轉錄因子的核巧酸序列在制備調控水稻抽穗期提 高水稻產量方面的應用。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過如下的方法予W實現(xiàn)： OsFBHI轉錄因子的核巧酸序列，其特征在于OsFBHI基因的核巧酸序列為SEQIDNo. 1 所示，OsFB化編碼一個399個氨基酸的蛋白質序列為SEQIDNo2所示。
[0007] 本發(fā)明所述OsFB化轉錄因子核巧酸序列的mRNA序列為SEQIDNo. 3所示。
[000引本發(fā)明所述OsFBHI轉錄因子的核巧酸序列在制備調控水稻抽穗期方面，特別是 在提高水稻產量方面有明顯的提高。試驗研究表明：過表達化巧?似延遲了水稻的抽穗日 期，增加水稻的分葉，從而可W提高水稻產量。
[0009] 本發(fā)明所述Os化xlO的基因序列如下（SEQIDNo. 1所示）： OsFBHl基因序列：


【附圖說明】： 圖1轉基因植株的獲得及分子檢測；其中：A:愈傷組織的繼代培養(yǎng)；B:浸染后的愈 傷組織篩選培養(yǎng)；C:愈傷組織的分化培養(yǎng)；D:幼苗的生根培養(yǎng)；E:T。代過表達轉基因植 株PCR檢測，1-18分別代表T。代過表達轉基因植株，WT:野生型，P:重組質粒，CK:d地2〇 ; 圖2化轉基因植的表型；其中：A:過表達轉基因植株的realtime-PCR分析， 1-8分別過表達轉基因植株WT為野生型；B:過表達轉基因植株的表型分析，OsFB化-0V1 過表達植株體系，WT:為野生型； 圖3化的表達模式；其中：圖中A-0為轉基因植株在不同組織和器官中GUS染色 結果，其中N、0為轉基因植株葉片的橫切面圖；A:根巧：莖；C:莖頂端分生組織；D:愈傷組 織；E:葉片；F:葉銷；G-J不同時期的幼穗；K-L:花器官。標尺為50ym。P:化做做在不同 組織中的Realtime-PCR表達分析。YM:莖頂端分生組織；YR:幼根；YL:幼葉；MS:葉銷； S:莖；P1 :4cm長幼穗；P2 :13cm長幼穗；P3 :開花前幼穗； 圖4化規(guī)做基因的亞細胞定位；其中：A-C:融合載體P化規(guī)做/.?做7在煙草表皮細胞 的瞬時表達，Merged為GFP、DPAI場融合；D-F:空載體在煙草表皮細胞的瞬時表達，Bri曲t field為明場，Merged為明場和GFP暗場的疊加；G-I:融合載體P化?做7在洋蔥細胞 表皮細胞的瞬時表達，Bri曲tfield為明場，Merged為明場和GFP暗場的疊加J-L:為空 載體在洋蔥表皮細胞中的瞬時表達。
【具體實施方式】
[0010] 下面通過具體實施例并結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明。W下各實施例 僅僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。需要特別說明的是實施例中所用到的試劑均由市售， 化基因序列由RT-PCR擴增獲得并克隆到空載體中。
[0011] 其中所用到的名詞解釋及來源：
實施例1 1. 意義 本發(fā)明利用反向遺傳學方法對水稻化巧?似的功能進行了研究，結果表明化巧?似可W調控水稻的抽穗期早晚。對水稻產量有重要影響；同時水稻抽穗開花的早晚常伴隨著水稻 巧粒產量的變化，因此清晰的掲示水稻成花的分子調控通路，利用分子設計輔助育種，對于 提高水稻產量具有廣闊的應用前景。
[0012] 2材料與方法 2. 1植物材料 梗稻品種日本晴及其轉基因植株用于本研究。材料種植海南陵水中國水稻所南繁基地 及天津市農科院試驗田。
[001引 2. 2方法 2. 1. 1化過表達載體的構建 總RNA從40天的水稻葉片中用Trizol試劑（Invit;rogen，USA)提取，2yg總RNA用M-MLV反轉錄酶（TaKaRa，china)反轉錄合成cDNA。W反轉錄得到的cDNA為模板，用基因 特異性引物FBHF:5' -TTGGGATCCTGGGTTGAGGTGGGAGAATT-3^ 和陽皿:5'-CAGACTAGTTCCTGC CTAATCTCCAAAAC-3'，進行PCR擴增獲得目的基因的完整0RF。將獲得的目的片段純化回收 后，用目的載體中相應的酶切位點連入空載體中獲得最終過表達載體。PCR反應條件為1 min/ 95°C; 35cycles(30sec/ 94°C, 30sec/ 62°C, 2min/ 72°C) ; 5min/ 72°C。反應體系如下（總體積20yL): DM 10 - 30ng 10XBuffer(含 20mlMg2+) 2yL dNTP(2. 5mM) 0. 2mM PrimerF(FBHF) 0. 2yM PrimerR(FBHR) 0. 2yM ExTaq酶（TaKaRa) lU dd&O補至 20yL 2. 2. 3轉基因植株的分子檢測 基因組DM用CTAB法從水稻葉片中提取。然后用載體中潮霉素抗性基因對獲得 的過表達轉基因植株進行檢測，所用引物為出PTF: 5 '-CTTCTGCGGGCGATTTGT-3'和 HPTR:5<-CAGCGTCTCCGACCTGAT-3，。PCR擴增程序為 2min/ 95°C; 30巧cles(30sec/ 94°C，30sec/ 57°C，30sec/ 72°C) ; 5min/ 72°C。
[0014] 2.2.4目的基因的表達分析 對于組織特異性表達，收集水稻根、莖、葉、葉片、葉銷、莖和不同發(fā)育時期的穗組織，用Trizol試劑（Invitrogen，USA)提取運些組織的總RNA，反轉錄后用RT-PCR方法分析目的 基因在運些器官中的表達。對于轉基因植株表達檢測，總RNA從50天大小的植株用上述相 同方法獲得，反轉錄后用RT-PCR方法分析目的基因的表達。
[0015]所用引物為 0BF:5 < -ATCAGCGAGCGAATCAGGAAGC-3 ' 和RHLH1R:5 <-cacTGCTCCATTGCCCTTTGCT-3,。
[0016]擴增條件為2 min / 95°C ;35巧cles (30 sec / 94°C , 30 sec / 60°C , 30 sec / 72°C ) ; 5 min / 72°C。實時定量PCR應用SYBR方法按照SYBR Green PCR預混液 (Tiangen，北京）試劑盒說明操作，并用2-AAEt方法進行相對定量分析，重復3次。w水 稻化打7為內參進行相對定量分析。引物為ActinF: 5 '-GACTCTGGTGATGGTGTC