一種應(yīng)用宮頸癌側(cè)群細(xì)胞預(yù)測放化療敏感性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種應(yīng)用宮頸癌側(cè)群細(xì)胞預(yù)測放化療敏 感性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌的發(fā)病率占全球婦女惡性腫瘤的第二位，僅次于乳腺癌。我國每年有新發(fā) 病例10萬左右，約占全世界宮頸癌新發(fā)病例的1/5。在發(fā)展中國家，婦女宮頸癌的死亡率超 過了乳腺癌，居女性惡性腫瘤死因之首。今年來我國局部地區(qū)子宮頸癌的發(fā)病率和死亡率 有增長趨勢，部分地區(qū)還出現(xiàn)患病的年輕化趨勢。宮頸癌的治療采用W手術(shù)和放療為主，化 療為輔的綜合治療方案。早期宮頸癌的治療效果較好，但I(xiàn)V期和復(fù)發(fā)性宮頸癌的5年生存 率僅為3. 2%~13%，復(fù)發(fā)大多數(shù)發(fā)生在診斷后2年內(nèi)，預(yù)后差，中位存活期是7個月。因 此宮頸癌是嚴(yán)重威脅全球婦女健康和生命的疾病之一。
[0003] 腫瘤干細(xì)胞（cancerstemcell,CSC)理論是當(dāng)前腫瘤學(xué)領(lǐng)域里的研究熱點，該理 論認(rèn)為：腫瘤中的細(xì)胞具有異質(zhì)性，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞不具有無限增殖力，僅有少數(shù)腫瘤細(xì)胞 具有與干細(xì)胞相似的無限增殖潛能和多項分化性特征，所有腫瘤細(xì)胞均來源于運些腫瘤干 細(xì)胞，運些占腫瘤細(xì)胞數(shù)量0. 1% -1 %的腫瘤干細(xì)胞是所有腫瘤細(xì)胞的祖細(xì)胞，對化療藥 物及放療耐受，是導(dǎo)致腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的根源。因此，探尋宮頸癌的細(xì)胞起源，研究它 們的生物學(xué)特性，可W為宮頸癌的預(yù)防、篩查提供新的思路，為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者的 治療指明新的方向。
[0004] 腫瘤干細(xì)胞的分離及鑒定是腫瘤干細(xì)胞研究的首要步驟。通過CSC表面特異性 標(biāo)志篩選法分離干細(xì)胞可信度高，是鑒定CSC最權(quán)威的方法，然而，迄今為止，只有部分 腫瘤的干細(xì)胞表面標(biāo)記物被鑒定出來。1996年Goodell等在用DNA染料為造血干細(xì)胞 Hoechst33342 染色并進(jìn)行巧光活化細(xì)胞分選（fluorescenceactivatedcellso;rting， FAC巧時發(fā)現(xiàn)有一群染色偏低、與其他大部分細(xì)胞不一樣的細(xì)胞群體。利用該特性分離的運 部分細(xì)胞被稱為側(cè)群細(xì)胞（Sidepopulation,SP)，運種可W排除化echest33342的特性被 稱為SP表型。隨著對SP細(xì)胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的功能與正常干細(xì)胞相似，可發(fā) 生不對稱分裂、進(jìn)行自我更新等等，所W目前SP表型已成為分選腫瘤干細(xì)胞的常用方法之 一。近年來已有研究提示宮頸癌SP表型具備腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的生物學(xué)特性，可W考慮作 為分選宮頸癌干細(xì)胞的有效方法。2010年國內(nèi)學(xué)者馮下慶等首次報道從19例不同臨床分 期的宮頸癌組織中分離獲得的單細(xì)胞懸液經(jīng)過腫瘤細(xì)胞球培養(yǎng)液（TSM)培養(yǎng)后八例有懸 浮的腫瘤細(xì)胞球形成，實驗證實運些細(xì)胞符合干細(xì)胞特征。但是相關(guān)實驗不多，且目前近年 的研究也主要集中在分離及對其進(jìn)行生物學(xué)功能的鑒定方面，而關(guān)于放化療敏感性的相關(guān) 研究未見報道。
[0005] 現(xiàn)已公認(rèn)，腫瘤干細(xì)胞的一大特性就是對化療藥物抵抗。ABCG2蛋白是ABC結(jié)合盒 (ATP-bindingcassette，ABC)超家族成員之一，是一種P糖蛋白，在維持細(xì)胞自身穩(wěn)定及 機體正常生理功能等方面起著重要作用，由ABCG2表達(dá)與SP表型的直接相關(guān)性可知細(xì)胞對 藥物敏感性的下降是ABCG2的表達(dá)造成的。隨著對ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族其他分子如ABCBl、ABCC2研究的日益深入，研究者們認(rèn)為，其他的ABC轉(zhuǎn)運蛋白也可能是形成SP表型的原因， 因而也是SP細(xì)胞多藥耐藥的分子基礎(chǔ)。
[0006] 放射治療在宮頸癌的治療中占有重要地位。據(jù)統(tǒng)計，大約有80%的宮頸癌患者 需要放射治療作為單獨治療或綜合治療的手段之一。放療已經(jīng)用于各個臨床期別的宮頸 癌，但近年來其療效的提高并不理想，部分腫瘤細(xì)胞對放療不甚敏感，臨床I、II期患者放 療后5年生存率為65%~85% ;111、IV期患者約20%~50%。腫瘤干細(xì)胞放射抗拒的機制 可能與損傷DNA的修復(fù)、影響細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞調(diào)亡、增殖等轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路改變有關(guān)。已 有證據(jù)顯示乳腺癌、膠質(zhì)瘤等實體腫瘤對放療的不敏感性與CSCs的存在有關(guān)，可W大膽 地推測，晚期或復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的宮頸癌放療不敏感性與SP細(xì)胞的放射線抵抗有關(guān)。通過檢測 放療敏感相關(guān)因子可W了解腫瘤內(nèi)在的放射敏感性，研究表明在惡性腫瘤中，抑癌基因 P53過表達(dá)是一普遍現(xiàn)象，可進(jìn)行DNA修復(fù)或啟動調(diào)亡程序令細(xì)胞死亡，在福射損傷修復(fù)中 起重要作用，并與細(xì)胞放射敏感性有一定關(guān)系。上皮生長因子受體（epiderma1growth factorrec巧tor,EGFR)是活化的原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物，一種跨膜酪氨酸激酶生長因子的 受體，在很多腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，與腫瘤的預(yù)后有密切的關(guān)系。研究還認(rèn)為EGFR升高與 腫瘤放療療效相關(guān)，EGFR信號途徑是影響腫瘤細(xì)胞放療敏感性的重要因素，它的過度表達(dá) 會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對放射線的抵抗，可W認(rèn)為EGFR是預(yù)測放療敏感性的重要指標(biāo)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用宮頸癌側(cè)群細(xì)胞預(yù)測放化療敏感性 的方法。
[0008] 為解決上述問題，本發(fā)明一種應(yīng)用宮頸癌側(cè)群細(xì)胞預(yù)測放化療敏感性的方法，其 特征在于，包括如下步驟：
[0009] (1)通過手術(shù)來源獲得患者宮頸癌組織；
[0010] (2)制備原代宮頸癌細(xì)胞懸液：
[0011] 取手術(shù)切除的新鮮宮頸癌腫瘤組織，無菌生理鹽水沖洗干凈，剪成1mm3大小的碎 塊，加入終濃度為0. 1 %的膠原酶，0. 01 %透明質(zhì)酸酶，0. 002%的DNA酶，37°C消化2小時， 100目尼龍網(wǎng)過濾，500巧m離屯、lOmin，棄上清，加入適量Hanks液，混勻后行不連續(xù)密度梯 度離屯、，200化pm20min，收集富含腫瘤細(xì)胞的懸液，洗涂2次后，用含10%血清的DMEM培養(yǎng) 液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至試驗備用；
[001引 做將宮頸癌細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中，于37°C、5%C02、95%濕度條件下的解箱中常 規(guī)貼壁培養(yǎng)；
[001引 （4)收集對數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至IX106個/mL，將細(xì)胞分成兩 組，一組加入化echst33342至終濃度為5mg/l，另一組同時加入50ymol/L利舍平作為對 照；混勻細(xì)胞重懸于冰冷的含2 %FBS的DMEM培養(yǎng)基，用超速流式細(xì)胞分選系統(tǒng)分選SP細(xì) 胞，分選后得到的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞用于進(jìn)一步的實驗研究；
[0014] 妨收集對數(shù)生長期的SP和NSP細(xì)胞，消化后制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2X1〇5個/mU接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后換液，NSP細(xì)胞和SP細(xì)胞分別加入不同濃度的順 銷，培養(yǎng)24h后消化，PBS洗涂，AnnexinVFITC細(xì)胞調(diào)亡檢測試劑盒染色，流式細(xì)胞儀檢 ，細(xì)胞調(diào)亡率=UR% +LR% ;
[001引 （6)收集對數(shù)生長期的SP和NSP細(xì)胞，消化后制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2X105個/mU接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后換液，SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞給予不同劑量的放療照 射，培養(yǎng)24h后消化，PBS洗涂1次；AnnexinVFITC細(xì)胞調(diào)亡檢測試劑盒染色，流式細(xì)胞儀 檢測，細(xì)胞調(diào)亡率=UR% +LR%。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述的步驟（5)可W和步驟（6)前后順序互換。
[0017] 本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟巧）中，NSP細(xì)胞和SP細(xì)胞分別加入不同濃 度的順銷 0yg/mL、0. 475yg/mL、0. 95yg/mL和 1. 9yg/mL。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述步驟化）中，NSP細(xì)胞和SP細(xì)胞分別給予不同劑 量0, 2,4,8Gy照射的放療照射。
[001引所述步驟（3)中DMBl培養(yǎng)基含有10%FBS、100U/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素。
[0020] 本發(fā)明的實施例方案中，所述的宮頸癌細(xì)胞選自化La細(xì)胞。
[0021] 本發(fā)明采用Goodell等所報道的經(jīng)典的化echst33342染色方法與流式細(xì)胞儀相 結(jié)合，對宮頸癌Hela細(xì)胞中的SP細(xì)胞及NSP細(xì)胞進(jìn)行分選，觀察細(xì)胞生長及體外克隆形成 情況，進(jìn)一步進(jìn)行化療及放療敏感性實驗，觀察兩者對化療藥物順銷及放射線的反應(yīng)性差 異，同時探索了可能的相關(guān)機制，為深入研究宮頸癌干細(xì)胞提供研究模型和基礎(chǔ)，為臨床應(yīng) 用提供了依據(jù)。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點包括如下：
[0023] 1、腫瘤干細(xì)胞與腫瘤發(fā)生，發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切，受到越來越多的關(guān)注，運些研 究主要集中在分選宮頸癌干細(xì)胞及對其進(jìn)行生物學(xué)功能的鑒定方面，但是目前為止關(guān)于放 化療敏感性的相關(guān)研究未見報道。
[0024] 2、本發(fā)明研究了腫瘤干細(xì)胞與放化療抵抗的相關(guān)性，將治療的重屯、轉(zhuǎn)向腫瘤干細(xì) 胞，力求根除腫瘤干細(xì)胞，使腫瘤整體的增殖能力下降，腫瘤逐漸退化萎縮，從而真正治愈 腫瘤。
[00巧]3、本發(fā)明WSP細(xì)胞作