一種檢測dnmt3a基因突變的引物與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種檢測DNMT3A基因突變的引物與方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性髓細胞性白血病（Acutemyeloidleukemia,AML)是髓系造血干/祖細胞惡 性疾病。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，在人類腫瘤疾病中，腫瘤相關(guān)基因會發(fā)生低甲基化或超甲基化 現(xiàn)象，即DNA甲基化模式的改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)?；蚪M甲基化模式的建立和維持 由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmet的ltransferases，DNMTs)負責(zé)完成。在哺乳動物中，主要存在 3類具有催化活性的DNMTs，分別為DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和1個缺少甲基轉(zhuǎn)移酶活性的類 似蛋白DNMT化。其中，DNMT3A和DNMT3B主要起從頭甲基化作用，是腫瘤遺傳機制的重要分 子。
[0003]目前有研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A基因丟失或發(fā)生突變導(dǎo)致造血干細胞的分化缺陷，據(jù)報 道，DNMT3A基因突變在AML患者中的發(fā)生頻率為17. 8%-22. 1%，與野生型DNMT3A的AML患者 相比，DNMT3A基因突變患者往往為正常核型，并伴隨NPM1、FLT3、imn等基因的突變。AML 患者的DNMT3A基因最常見的突變位點為R882(R882H，R882C，R882P，R882巧。因此，檢測 DNMT3A基因的突變位點可W作為識別正常核型AML患者的預(yù)后指標。
[0004] 中國專利申請201310459210. 2公開了一種檢測DNMT3A突變位點的方法、引物和 試劑盒，該試劑盒包括樣品基因組DNA抽提試劑、無水乙醇、檢測體系PCR反應(yīng)液、測序體系 反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，用于DNMT3A基因R882位點突變的檢測存 在反應(yīng)體系復(fù)雜和檢測步驟復(fù)雜的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種檢測DNMT3A基因突變的引物與 方法，該引物具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點，實現(xiàn)了DNMT3A基因外顯子23突變的準確檢 測。
[0006] 本發(fā)明提供一種檢測DNMT3A基因突變的引物，包括針對DNMT3A基因外顯子23的 上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTAGGAGTTGGTGGGTGTGAG(沈QIDNO. 1)和下游引物CAGGAAA CAGCTATGACCATGATGTCCAACCCTTTTCG(沈QIDNO. 2)。
[0007] 進一步地，所述引物中外顯子23的上游引物和外顯子23的下游引物濃度比為1 : 1〇
[000引另外，本發(fā)明還提供一種檢測DNMT3A基因突變的方法，包括如下步驟：A)提取DNA樣品；B)采用權(quán)利要求1或2中所述的引物進行PCR擴增；C)對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分 析后，采用Sanger測序法檢測，對檢測結(jié)果進行分析。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟A)中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血或骨髓血的DNA樣品。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟B)中的PCR擴增反應(yīng)條件包括：階段1 :98°C3min;階段2 :98°C 1〇3;階段3:631：3〇3;階段4:72°(：1111111;階段5:返回到階段2,34個循環(huán)；階段6:721： 5min;階段7 :25°C保溫。
[0011] 優(yōu)選地，所述步驟c)中，采用Sequencher 4. 1. 4軟件對檢測結(jié)果進行分析。
[0012] 此外，本發(fā)明還提供檢測DNMT3A基因突變的引物在制備檢測DNMT3A基因突變試 劑中的用途。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種檢測DNMT3A基因外顯 子23突變的引物，該引物的特異性好，準確性好，提高了檢測效率。此外，本發(fā)明還提供了 一種檢測DNMT3A基因外顯子23突變的方法，通過使用特異性的引物，具有特異性好、靈敏 度高、準確性好等優(yōu)點，DNMT3A基因突變可W作為識別正常核型AML患者中的不同亞型的 預(yù)后指標，為臨床用藥提供指導(dǎo)。
【附圖說明】
[0014]圖 1 本發(fā)明提供的DNMT3A基因引物值NMT3A_R882_M13F&DNMT3A_R882_M13R)擴 增片段； 圖2PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖； 圖3DNMT3A基因外顯子23 (野生型）的部分測序圖； 圖4DDNMT3A基因外顯子23(c. 2645G〉A(chǔ))的部分測序圖。
【具體實施方式】
[0015] W上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于運些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的 保護范圍。
[001引實施例1、引物 發(fā)明人針對DNMT3A基因外顯子23,設(shè)計了大量引物，通過引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和比 較，篩選出了特異性好的引物。
[0017]表1本發(fā)明提供的引物
實施例2、引物的特異性檢測 (1)將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進行Blasting,引物對DNMT3A_R882_M13F/DNMT3A_R882_M13R擴增片段位于C虹2:25456954-25457431間，長度為478bp。沒有其它同源基因， 與DNMT3A基因參考序列吻合。
[001引 （2)提取邸TA抗凝外周血的DNA樣品，提取方法參照TIANampBloodDNAKit(購 自Tiagen，貨號：DP318)的說明書，將DM樣品稀釋至lOOng/化，備用。
[0019] PCR擴增采用Q5?熱啟動超保真2X Master Mix(購自肥B公司，貨號：M049化），PCR 擴增體系如表2所示，PCR擴增條件如表3所示。外顯子23的上游引物和外顯子23的下 游引物濃度比為1 :1，外顯子23的上游引物濃度和外顯子23的下游引物濃度均為lOpmol/ Ulo
[0020]
對PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物的特異性高， 無非特異性擴增條帶產(chǎn)生。采用Bi曲ye?Terminatorv3. 1(購自Life公司，貨號4336919)。 [002。 對檢測樣本的PCR產(chǎn)物進行Sanger測序，具體Sanger測序的操作步驟如下： A)DNA測序模板處理，加入ExoSAP-IT酶，在ABI9700PCR儀中，下程序進行處 理：37 °C，15min; 80 °C，15min; 4°C，infinite。
[0022]B)參考Bi曲ye?Terminatorv3. 1 切cleSequencingKit操作說明制備測序 PCR體系。
[002引C)在ABI9700PCR儀中，按W下程序進行處理： 96°C，1min-（96°C，10sec- 50°C，5sec- 60°C，4min)，25 個循環(huán)一 4°C保溫D)用酒精/EDTA/NaAc法對測序PCR的產(chǎn)物進行純化。
[0024] 巧室溫揮發(fā)凈酒精，加入lOyL化-Di化rmamide溶解DNA，溶解后的樣品需要在 95°C變性4min,迅速置冰中冷卻4min后，上樣電泳。
[0025] 測序結(jié)果顯示，擴增片段與參考序列吻合（見圖3和4)。
[0026] 實施例3、檢測DNMT3A基因外顯子23突變方法的準確性 本檢測準確度定義為不同引物檢測結(jié)果的一致性。
[0027] 本檢測使用表4中的檢測引物對22例血液樣本DNA進行檢測，所有DNA樣本均使 用表4中的驗證引物進行驗證，結(jié)果如表5所示。22例樣本經(jīng)兩套不同引物檢測，檢測結(jié)果 一致。本檢測準確度為100%。
[0028] 表4本發(fā)明提供的驗證引物
注：NMD即未檢測到突變。
[0029] 實施例4、檢測DNMT3A基因外顯子23突變方法的特異性和靈敏度 本檢測的檢測特異性定義為陰性符合率，檢測靈敏度定義為陽性符合率。
[0030] 本檢測使用表1中的檢測引物對22例血液樣本DNA進行檢測，所有DNA樣本均使 用表4中的驗證引物進行驗證，結(jié)果如表5所示。
[0031] 兩對引物檢測結(jié)果為陰性（未檢測到突變）的樣本完全一致，本檢測的檢測特異 性為 100〇/〇。
[0032] 兩對引物檢測結(jié)果為陽性（檢測到突變）的樣本完全一致，突變位點及類型也完 全一致，本檢測的檢測靈敏度為100%。
[0033] 表6檢測特異性及檢測靈敏度
實施例5、檢測DNMT3A基因外顯子23突變方法的檢測下限 (1)本檢測采用Sanger測序法進行檢測，建立Sanger測序平臺時進行了相關(guān)驗證，驗 證結(jié)果表明，Sanger測序法的最低檢測下限化0D)為20%，當突變細胞與正常細胞的比值低 于40%時，不排除假陰性的可能。
[0034]U)根據(jù)DNA輸入量的檢測結(jié)果顯示，在DNA量輸入范圍12. 5~200ng/reaction 間，可保證突變樣本檢測結(jié)果一致。
[0035] 實施例6、檢測DNMT3A基因外顯子23突變方法的精密度 本檢測方法的精密度定義為對樣品進行重復(fù)檢測得到同一結(jié)果的能力。
[0036] (1)批內(nèi)精密度：本檢測對1例陽性樣本和1例陰性樣本進行了DNMT3A基因外顯 子23的3復(fù)孔檢測。同一樣本不同孔間的擴增均成功，Sanger測序結(jié)果如表7所示。結(jié) 果顯示，同一樣本不同孔間的檢測結(jié)果一致。本檢測的批內(nèi)精密度為100%。
[0037] 表7批內(nèi)精密度結(jié)果
注：NMD即未檢測到突變。
[003引（2)批間精密度：本檢測對7例樣本進行了DNMT3A基因外顯子23的S次檢測。同 一樣本不同批次的擴增均成功，Sanger測序結(jié)果如表8所示。結(jié)果顯示，同一樣本不同批 次的檢測結(jié)果一致。本檢測批內(nèi)精密度為100%。
[0039] 表8批間精密度結(jié)果
注：NMD即未檢測到突變。
[0040]因此，本發(fā)明所提供的引物和檢測方法可作為一種獨立的、應(yīng)用廣泛的檢測方法， 解決了DNMT3A基因外顯子23突變的檢測問題，可W作為預(yù)后指標識別正常核型AML患者 中的不同亞型，為臨床用藥提供指導(dǎo)，減少不良反應(yīng)，在幫助指導(dǎo)用藥和個性化治療方面具 有重要意義。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測DNMT3A基因突變的引物，其特征在于，包括針對DNMT3A基因外顯子23的 上游引物 TGTAAAACGACGGCCAGTAGGAGTTGGTGGGTGTGAG 和下游引物 CAGGAAACAGCTATGACCATG ATGTCCAACCCTTTTCG。2. 如權(quán)利要求1所述的檢測DNMT3A基因突變的引物，其特征在于，所述引物中外顯子 23的上游引物和外顯子23的下游引物濃度比為1 :1。3. -種檢測DNMT3A基因突變的方法，其特征在于，包括如下步驟：A)提取DNA樣品；B) 采用權(quán)利要求1或2中所述的引物進行PCR擴增；C)對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析后，采 用Sanger測序法檢測，對檢測結(jié)果進行分析。4. 如權(quán)利要求3所述的檢測DNMT3A基因突變的方法，其特征在于，所述步驟A)中的 DNA樣品為EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA樣品。5. 如權(quán)利要求3所述的檢測DNMT3A基因突變的方法，其特征在于，所述步驟B)中的 PCR擴增反應(yīng)條件包括：階段I:98°C3min;階段2 :98°CIOs;階段3 :63°C30s;階段4 : 72°(：11^11;階段5:返回到階段2,34個循環(huán)；階段6:72 1€51^11;階段7:25°(：保溫。6. 如權(quán)利要求3所述的檢測DNMT3A基因突變的方法，其特征在于：所述步驟C)中，采 用Sequencher4. 1. 4軟件對檢測結(jié)果進行分析。7. 如權(quán)利要求1或2所述的檢測DNMT3A基因突變的引物在制備檢測DNMT3A基因突變 試劑中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測DNMT3A基因突變的引物與方法。本發(fā)明提供的檢測DNMT3A基因突變的引物，包括針對DNMT3A基因外顯子23的上游引物和下游引物。本發(fā)明提供的引物可以實現(xiàn)DNMT3A基因外顯子23突變的特異性檢測，引物的特異性好，準確性好，提高了檢測效率。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105200129
【申請?zhí)枴緾N201510608008
【發(fā)明人】梁耀銘, 于世輝, 趙薇薇, 燕啟江, 胡昌明
【申請人】南寧金域醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月23日