花生MYB類轉(zhuǎn)錄因子AhMYB31及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了花生MYB類轉(zhuǎn)錄因子AhMYB31及其應(yīng)用，屬于生物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽成髓細(xì)胞瘤病毒致癌基因同源物類（v-mybavianmyeloblastosisviral oncogenehomolog,MYB)轉(zhuǎn)錄因子家族是一類含MYB結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，是植物轉(zhuǎn)錄因子 中數(shù)量最多、功能最多樣化的一個家族。結(jié)構(gòu)域是一段約51~52個氨基酸的膚段， 且每隔18~19個氨基酸就有一個保守的色氨酸殘基，它們參與空間結(jié)構(gòu)中疏水核屯、的形 成，對于維持螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTHAelix-turn-helix)構(gòu)型有特別重要的意義狂hong etal.，2007)。Paz-Ares等（1987)首次從玉米谷粒糊粉中克隆了C0L0RED1 (Cl)基因， 編碼一個具有MYB結(jié)構(gòu)域的蛋白，參與花青素合成。擬南芥基因組測序成功后，第一次全 面地對植物MYB基因家族進(jìn)行描述和分類，為系統(tǒng)研究MYB轉(zhuǎn)錄因子家族在植物中的作用 打下良好基礎(chǔ)（Strackeetal.，2001;Duetal.，2009)。根據(jù)所含肌B結(jié)構(gòu)域的數(shù)目不 同，植物中的MYB轉(zhuǎn)錄因子大體上可W分為S類：1)只含一個MYB結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白亞類， 可能是一類重要的端粒結(jié)合蛋白，在維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性和調(diào)芐基因轉(zhuǎn)錄上起重要作 用（化ristianetal.，2010);2)R2R3亞類成員含兩個結(jié)構(gòu)域，它們主要參與次生代 謝調(diào)節(jié)、控制細(xì)胞的分化、應(yīng)答激素的刺激W及抵御外界脅迫和病原菌的侵染（Matuset al.，2008) ;3)R1R2R3亞類成員含S個結(jié)構(gòu)域，主要參與控制細(xì)胞周期和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化 化agaetal. , 2007)
[0003] 目前已從許多植物中鑒定出多個肌B轉(zhuǎn)錄因子，其中又WR2R3型居多（Kranzet 曰1.，2000)，如擬南芥中已發(fā)現(xiàn)126個R2R3型成員（C虹istianet曰1.，2010)，玉米中該家 族成員有158個化aietal.，2012)。它們廣泛參與植物次生代謝的調(diào)控、對激素和環(huán)境 因子的應(yīng)答（Sugimotoetal.，2000)，并在細(xì)胞分化、器官的形成、植物葉片的形態(tài)建成及 抗病抗逆等方面具有重要的調(diào)控作用（Vailleauetal., 2002;Vanninietal., 2004;Du etal., 2009;Dubosetal., 2010;Felleretal., 2011;Czemmeletal., 2012)。目前， 其他作物中也相繼有MYB類轉(zhuǎn)錄因子的報道，如甘馨（Manoetal.，2007)、棉花（房棟等， 2008)、大豆（李曉薇等，2011)等，但它們的具體功能還有待進(jìn)一步的驗證?；ㄉ性擃愞D(zhuǎn) 錄因子鮮有報道，山東花生所化en等（2013)根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的保守性，利用生物軟件對花 生已公布的36741條ESTs序列進(jìn)行比對分析，獲得了 30個具有完整ORF(開放閱讀框）的 cDNA序列，命名為AhMYBl~30,結(jié)構(gòu)域分析其中9個基因為R2R3型；1個基因為R1R2R3 型；其余為IR型或MYB-relate型，但具體功能分析未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 技術(shù)問題
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)控植物耐鹽性的花生轉(zhuǎn)錄因子基因AhMYB31。 [000引技術(shù)方案
[0007] 本發(fā)明提供一種調(diào)控植物耐鹽性的花生MYB轉(zhuǎn)錄因子基因AhMYB31，所述基因 cDNA序列如沈QIDNO. 1所示。
[0008] 所述的調(diào)控植物耐鹽性的花生MB轉(zhuǎn)錄因子AhMYBS12基因編碼的蛋白質(zhì)，具有序 列表中SEQIDNO. 2所述的氨基酸序列。
[0009] 本發(fā)明所述AhMYB31基因的應(yīng)用。具體指AhMYB31基因具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，將 其通過植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入目的植物內(nèi)，能提高植物的耐鹽性。所述植物優(yōu)選是模式植物擬 南芥。
[0010] 有益效果
[0011] 本發(fā)明公開了花生R2R3-M1^類轉(zhuǎn)錄因子基因AhMYB31及其所編碼的蛋白質(zhì)，該 基因在花生中為首次報道。巧光定量表達(dá)分析表明該基因受高鹽脅迫誘導(dǎo)，AhMYB31表現(xiàn) 出高鹽脅迫響應(yīng)更為顯著，在脅迫處理1化后上調(diào)了近2倍。試驗表明AhMYB31轉(zhuǎn)錄因子 具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，轉(zhuǎn)擬南芥功能驗證顯示該基因的過量表達(dá)提高了擬南芥對高鹽的抗 性。因此有望作為目的基因?qū)胫参铮岣咧参锬望}性，從而進(jìn)行植物品種改良。
【附圖說明】
[001引圖1 :PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳結(jié)果
[0013]注：圖中M:DL2000marker;31 :AhMYB31
[0014] 圖2 :qPCR分析AhMYB31基因在高鹽和干旱下的表達(dá)情況
[0015] 圖3 :AhMYB31基因的轉(zhuǎn)錄自激活活性驗證
[0016] 注：圖中A為陽性對照：pGBKT7+pGADT7巧為陰性對照：pGBKT7 ;C為 pG服 17-AhM1^31。
[0017] 圖4 :MS培養(yǎng)基法鑒定AhMYB31擬南芥植株的耐鹽性
[0018] 注：圖A:萌發(fā)期耐鹽性鑒定的對照培養(yǎng)基；圖B:萌發(fā)期耐鹽性鑒定的鹽處理培 養(yǎng)基；圖C:幼苗期耐鹽性鑒定的對照培養(yǎng)基；圖D:幼苗期耐鹽性鑒定的鹽處理培養(yǎng)基
[0019] 圖5 ±培法耐鹽性鑒定結(jié)果
[0020] 注：圖（a)為對照誘清水處理；圖化）為鹽脅迫處理后
【具體實施方式】
[0021] 實施例1 :AhMYB31基因的獲得
[0022] 選用花生較抗旱品種：豐花1號（魯農(nóng)審字巧001]017號，江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資 源中期庫提供），光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)生長，待生長至3葉期幼苗，進(jìn)行干旱（20%PEG6000) 及高鹽（1%化Cl)處理，處理24h后分別取部分葉片等量混合放入研鉢中，在液氮下快速 研磨成粉狀，利用RNA提取試劑盒化Z.N.A.TMPlantRNAKit,購自O(shè)MEGA公司）提取樣 品的總RNA，并用DNAseI進(jìn)行消化處理。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性， NanoDrop-2000型分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。再通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反 轉(zhuǎn)合成CDNA。
[0023] 根據(jù)花生抗旱耐鹽相關(guān)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，挑選了差異表達(dá)的101條MYB相關(guān)序列， 去除部分重復(fù)序列，其余序列利用ORFFinder(ht1:p://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/ go計/)進(jìn)行ORF分析，篩選出10個具有完整ORF的序列。分別根據(jù)運(yùn)些預(yù)測序列的5和 3端的非編碼區(qū)設(shè)計特異性引物，W上述花生抗旱耐鹽的cDNA為模板，嘗試不同PCR反應(yīng) 條件后，最終僅擴(kuò)增出4個預(yù)測序列，分別為AhMYB31-34。其中AhMYB31的PCR引物為PU P2 (表1)，反應(yīng)條件為
[0024] 94°(：預(yù)變性5111111;94°(：變性3〇3,58-60°(：退火3〇3,72°(：延伸6〇3,35個循環(huán)； 72°C延伸lOmin。擴(kuò)增出的目的片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1)，回收后連接到質(zhì) 粒載體pGEM-T，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109燈aKaRa)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)選擇性LB培養(yǎng)基 (IPTG、X-gal、Amp)得到陽性克隆，菌液培養(yǎng)后測序分析。測得序列與預(yù)測序列一致，命名 為AhMYB31，AhMYB31的cDNA序列如沈QIDNO. 1所示，編碼的蛋白序列如沈QIDNO. 2 所示；結(jié)構(gòu)域分析顯示其具有2個MYB-DNA結(jié)構(gòu)域巧2、R3);系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明與擬南芥 的AtMYB60、30、31、96、94 親緣關(guān)系近。
[002引表1:說明書中設(shè)及的引物相關(guān)信息
[0027] 實施例2 :AhMYB31基因的表達(dá)分析
[0028] 選用花生品種：豐花1號，光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)生長，待生長至3葉期幼苗，分別進(jìn)行 干旱（20%陽G6000)及高鹽（1 %化Cl)處理，分別取化、地、化、1化的葉片樣品，液氮冷凍 后，-80°C冰箱保存。再利用RNA提取試劑盒化Z.N.A.TMPlantRNAKit,購自O(shè)MEGA公 司）分別提取樣品的總RNA，并反轉(zhuǎn)成cDNA。
[0029] 基于AhMYB31序列設(shè)計定量引物P3、P4(表1)，W花生18SR