一種檢測宮頸癌標(biāo)志物Survivin抗原表位氨基酸序列及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種通過生物信息學(xué)模擬篩選的具有檢測宮 頸癌標(biāo)志物Survivin多膚片段，人群流行病學(xué)檢測驗(yàn)證了其檢測敏感度及特異度，為進(jìn)一 步用于制備宮頸癌早期診斷及預(yù)后預(yù)測試劑盒奠定基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0003]宮頸癌是全球女性常見的癌癥之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌。近年來呈現(xiàn)地區(qū)增 長及發(fā)病年齡提前的現(xiàn)象。宮頸癌的病理類型、臨床期別與預(yù)后密切相關(guān)。宮頸癌早期診 斷有利于患者得到及時、有效的治療，控制疾病發(fā)展，提高女性的身體健康和生活質(zhì)量。血 液學(xué)檢查是最簡單的微創(chuàng)檢查手段，敏感、有針對性的腫瘤標(biāo)志物對于早期診斷宮頸癌有 助于臨床醫(yī)生的輔助診斷，減輕患者負(fù)擔(dān)，提高早期診斷率。大量研究表明，血清或血漿中 的腫瘤相關(guān)抗原能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生自身抗體，在腫瘤患者血清中既存在腫瘤抗原，也存在針 對該腫瘤抗原的自身抗體。因此，既可W利用抗體檢測腫瘤抗原，也可W利用抗原檢測腫 瘤抗原的自身抗體，但利用腫瘤自身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢 測腫瘤要高得多。很多腫瘤相關(guān)抗原不僅在腫瘤患者體內(nèi)存在，在正常人體內(nèi)也存在，因此 檢測腫瘤相關(guān)抗原作為診斷依據(jù)可信性差。而腫瘤自身抗體在正常人體內(nèi)含量很低檢測不 到或根本不存在，若體內(nèi)腫瘤自身抗體水平明顯增高，則表明體內(nèi)存在異常免疫情況，表明 體內(nèi)相關(guān)抗原水平發(fā)生波動，預(yù)示疾病的存在或原有疾病加重。
[0004] 近年來的研究表明，在惡性腫瘤體積發(fā)展到可用現(xiàn)代影像學(xué)技術(shù)檢出之前3-5 年，患者血中可出現(xiàn)高濃度的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體。因此，檢測血中腫瘤相關(guān)抗原自身抗 體具有預(yù)測腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和早期診斷腫瘤的重要價值。是腫瘤臨床診斷領(lǐng)域的重點(diǎn)發(fā)展方 向之一。在國外已有診斷肺癌和乳腺癌的早期診斷試劑盒市售。然而，目前所報(bào)道的自身 抗體檢測方法敏感度低，特異性差，假陰性比率可高達(dá)50%W上。其主要原因是由于每一種 腫瘤相關(guān)抗原自身抗體在癌癥患者中的陽性檢測率平均在10%左右。如何提高診斷試劑敏 感度是當(dāng)前需要亟待解決的關(guān)鍵問題。比較行之有效的方法是尋找新的可充當(dāng)腫瘤標(biāo)志物 的自身抗體，然后與現(xiàn)有已知的腫瘤相關(guān)抗原自身抗體組合成具有敏感度高和特異性強(qiáng)的 診斷試劑盒。
[0005] 人類survivin基因是1997年由Ambrosini最早發(fā)現(xiàn)，位于染色體17q25,全長 14. 7化，由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成，其編碼產(chǎn)生的蛋白由142個氨基酸組成，相對分 子量為16. 5kD，是近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosisprotein,IAP) 家族中的一個新成員，也是目前發(fā)現(xiàn)的具有重要意義的調(diào)亡抑制因子之一。Survivin兼 具有抑制細(xì)胞調(diào)亡和維持細(xì)胞有絲分裂的雙重功能，一般情況下在正常組織中幾乎不表 達(dá)。但在病理狀態(tài)下，Survivin可廣泛表達(dá)于各種惡性腫瘤組織中。Survivin的過表達(dá) 會抑制腫瘤細(xì)胞調(diào)亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖，Survivin蛋白過表達(dá)與病程進(jìn)展明顯相關(guān)， 抑制Survivin表達(dá)被認(rèn)為是一種有效緩解腫瘤的手段。在宮頸癌的研究中，研究人員發(fā) 現(xiàn)Survivin在宮頸慢性炎癥、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中依次升高的現(xiàn)象。也有報(bào)道表 明Survivin是判斷宮頸癌早期預(yù)后的指標(biāo)，早期宮頸癌中Survivin表達(dá)顯著升高，提示 Survivin在宮頸癌的診斷和預(yù)后具有重要價值。
[0006] 基于Survivin在腫瘤組織和正常組織間表達(dá)的巨大差異和其在腫瘤發(fā)展中的重 要作用，Survivin作為一個預(yù)測、預(yù)后指標(biāo)和抗癌治療祀點(diǎn)吸引了越來越多的關(guān)注。同時提 示我們其在宮頸癌早期診斷的應(yīng)用價值較好，W及作為潛在生物標(biāo)志物的可能。本發(fā)明通 過自行設(shè)計(jì)的Survivin抗原表位多膚，檢測腫瘤患者血清及血漿中自身抗體水平并開發(fā) 相應(yīng)的試劑，預(yù)測宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)性及預(yù)后預(yù)測，并為宮頸癌新藥研究提供可靠的數(shù)據(jù)。
[0007] 本發(fā)明通過自行設(shè)計(jì)的Survivin抗原表位多膚，檢測宮頸癌患者血清及血漿中 自身抗體表達(dá)水平并開發(fā)相應(yīng)的試劑，預(yù)測宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)性，并為制備宮頸癌早期診 斷及預(yù)后預(yù)測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是公開一種檢測宮頸癌標(biāo)志物Survivin自身抗體的抗 原表位序列。
[0009] 本發(fā)明同時公開了Survivin抗原表位的用途。
[0010] 本發(fā)明提供的一種檢測宮頸癌標(biāo)志物Survivin自身抗體的抗原表位氨基酸序列 為： H- DACT陽RMAEAGFmCPAGFmCPTE肥PD -OH其純度 >95%，pH〉7. 0。
[0011] 本發(fā)明所述的Survivin抗原表位多膚在制備宮頸癌早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明利用自行設(shè)計(jì)的Survivin蛋白的線性多膚，采用化ISA法檢測宮頸癌患者 血清及血漿中抗Survivin蛋白的特異性自身IgG抗體。自身IgG抗體水平升高表明腫瘤 患者體內(nèi)Survivin蛋白的表達(dá)量增加，預(yù)示患者可能出現(xiàn)原發(fā)性或繼發(fā)性宮頸癌，可W預(yù) 測宮頸癌發(fā)生與復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性，指導(dǎo)臨床醫(yī)生對宮頸癌的早期診斷及預(yù)后預(yù)測。
抗原抗體的結(jié)合實(shí)際上只發(fā)生在抗原決定簇和抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間，兩者在空間 結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上完全互補(bǔ)。因此抗原決定簇就可W代表整個蛋白與抗體結(jié)合的狀態(tài)與親 和特性。另外，W重組蛋白為抗原，要經(jīng)過載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、表達(dá)、篩選、純化等繁瑣的過程， 蛋白空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，抗原表位不易暴露，因此抗原抗體結(jié)合的特異性差。此外，ELISA法的 高靈敏性對純化技術(shù)的穩(wěn)定性要求極高，成本昂貴。
[0014] 發(fā)明人遵循W下原則設(shè)計(jì)線性多膚抗原：①選擇細(xì)胞膜蛋白表面區(qū)域；②選擇不 形成a-helix的序列；③兩端的膚段比中間的排列合理；④避免蛋白內(nèi)部重復(fù)；⑥避免同源 性強(qiáng)的膚段；⑧序列中盡量避免切S和Glu，不可W有太多的Pro,但有1-2個Pro利于膚鏈 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對產(chǎn)生特異性抗體有益。此外，該多膚抗原必須含有人類白細(xì)胞二類抗原（HLA) 系統(tǒng)的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DPandHLA-DQ的限制性表位。運(yùn)些表位可被90% W上華人群體的HLA二類抗原系統(tǒng)所識別?；赪上抗原設(shè)計(jì)原