一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳染病〔Infect1us Diseases〕是由各種病原體引起的能在人與人、動物與動物或人與動物之間相互傳播的一類疾病。病原體中大部分是微生物，小部分為寄生蟲，寄生蟲引起者又稱寄生蟲病。有些傳染病，防疫部門必須及時掌握其發(fā)病情況，及時采取對策，因此發(fā)現(xiàn)后應(yīng)按規(guī)定時間及時向當(dāng)?shù)胤酪卟块T報告，稱為法定傳染病。中國目前的法定傳染病有甲、乙、丙3類，共39種。
[0003]傳染病是一種可以從一個人或其他物種，經(jīng)過各種途徑傳染給另一個人或物種的感染病。通常這種疾病可借由直接接觸已感染之個體、感染者之體液及排泄物、感染者所污染到的物體，可以通過空氣傳播、水源傳播、食物傳播、接觸傳播、土壤傳播、垂直傳播等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種制備可以有效治療傳染病的人源化抗體的制備方法，它針對上述情況，發(fā)明一種操作簡便、成本低廉、高效的制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種制備可以有效治療傳染病的人源化抗體的方法，其特征在于它包括以下步驟:
[0006](I)收集大量傳染病細(xì)胞樣本及正常細(xì)胞樣本，并通過同位素標(biāo)記，多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析在傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子，對這些蛋白進行分離純化；
[0007](2)完成傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子人源化抗體的表達和純化；
[0008]1、用分離純化出來的細(xì)胞因子進行動物免疫。選擇6-8周齡的雌性BALB/c小白
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[0009]按照每只鼠150ug的量，與等體積的完全弗氏佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點注射。2-3周后加強免疫，抗原劑量同上，與弗氏不完全佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點或腹腔內(nèi)注射。
[0010]免疫7-15天后小白鼠尾靜脈采血，收集血清。間接法ELISA測定血清中針對的抗體滴度。如果抗體滴度在1: 15000以上，可以在融合前三天加強免疫，150uL的PBS溶解50ug傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子腹腔內(nèi)注射或靜脈注射。否則，繼續(xù)進行每兩周一次免疫，直到達到較高的抗體滴度。
[0011]2、細(xì)胞融合和篩選。為了產(chǎn)生分泌治療傳染病細(xì)胞因子的人源化抗體的雜交瘤細(xì)胞，將對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞與免疫小白鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液混合，然后在聚乙二醇。
[0012](PEG)介導(dǎo)的條件下融合:脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在15: I的比例混合。將細(xì)胞的混合物用無血清MDM培養(yǎng)基洗滌至少3次。于37°C水浴中，向細(xì)胞團中逐滴加入50 % PEG，并輕輕搖動細(xì)胞沉淀，再經(jīng)無血清的MDM培養(yǎng)基洗滌I次。用含有HAT的完全培養(yǎng)基重懸融合后的細(xì)胞團，輕輕吹打至細(xì)胞團散開，并按200ul/Well接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。之后，每隔2-3天半量更換培養(yǎng)基，直到雜交瘤細(xì)胞克隆足夠大可以篩選。間接法ELISA篩選分泌針對傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子的抗體陽性細(xì)胞孔。首次確定為陽性細(xì)胞孔，經(jīng)過有限稀釋法，至少亞克隆3次，保證陽性率在150%，獲得可以穩(wěn)定分泌傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0013]3、腹水制備:選擇6-8周齡的BALB/c小白鼠，每只小白鼠腹腔注射0.5ml石蠟油，7-15天后注射雜交瘤細(xì)胞。注射細(xì)胞后15天左右收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得純度較高的治療傳染病細(xì)胞因子的人源化抗體。
【具體實施方式】
[0014]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0015]以下將通過【具體實施方式】的形式再對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅局限于以下的【具體實施方式】，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0016]實施例1:傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子的獲得通過同位素標(biāo)記、多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析200多個傳染病細(xì)胞樣本與200多個正常細(xì)胞樣本，找出5-8個在傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子，分離純化出這幾個細(xì)胞因子；
[0017]實施例2:傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子人源化抗體的表達
[0018]1、用分離純化出來的細(xì)胞因子進行動物免疫。
[0019]選擇6-8周齡的雌性BALB/c小白鼠。按照每只鼠150ug的量，與等體積的完全弗氏佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點注射。2-3周后加強免疫，抗原劑量同上，與弗氏不完全佐劑混合乳化，乳濁液皮下多點或腹腔內(nèi)注射。免疫7-15天后小白鼠尾靜脈采血，收集血清。間接法ELISA測定血清中針對的抗體滴度。如果抗體滴度在1:1w以上，可以在融合前三天加強免疫，150 μ L的PBS溶解50ug傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子腹腔內(nèi)注射或靜脈注射。否則，繼續(xù)進行每兩周一次免疫，直到達到較高的抗體滴度。
[0020]2、細(xì)胞融合和篩選。
[0021]為了產(chǎn)生分泌傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子的人源化抗體的雜交瘤細(xì)胞，將對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞與免疫小白鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液混合，然后在聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的條件下融合:脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在15: I的比例混合。將細(xì)胞的混合物用無血清HffiM培養(yǎng)基洗滌至少3次。于37°C水浴中，向細(xì)胞團中逐滴加入50% PEG，并輕輕搖動細(xì)胞沉淀，再經(jīng)無血清的MDM培養(yǎng)基洗滌I次。用含有HAT的完全培養(yǎng)基重懸融合后的細(xì)胞團，輕輕吹打至細(xì)胞團散開，并按200ul/well接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。之后，每隔2_3天半量更換培養(yǎng)基，直到雜交瘤細(xì)胞克隆足夠大可以篩選。間接法ELISA篩選分泌針對傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子的抗體陽性細(xì)胞孔。首次確定為陽性細(xì)胞孔，經(jīng)過有限稀釋法，至少亞克隆3次，保證陽性率在150%，獲得可以穩(wěn)定分泌傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0022]實施例3:傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子的人源化抗體的純化選擇6-8周齡的BALB/c小白鼠，每只小白鼠腹腔注射0.5ml石蠟油，7_15天后注射雜交瘤細(xì)胞。注射細(xì)胞后15天左右收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得純度較高的傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子的人源化抗體。
[0023]本發(fā)明方案所公開的技術(shù)手段不僅限于上述實施方式所公開的技術(shù)手段，還包括由以上技術(shù)特征任意組合所組成的技術(shù)方案。
【主權(quán)項】
1.一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于它包括以下步驟:(I)傳染病中特異表達細(xì)胞因子的分離純化；(2)傳染病中特異表達細(xì)胞因子的人源化抗體的表達；(3)傳染病中特異表達細(xì)胞因子人源化抗體的純化，通過同位素標(biāo)記、多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法找出在傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，用在傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子對小白鼠進行免疫，如果抗體滴度在I: 8000-1: 12000以上時，可將免疫小白鼠脾細(xì)胞與對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞融合并篩選。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于向小白鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，注射細(xì)胞后8-12天收集腹水，protein G/A柱子純化腹水，獲得治療傳染病的人源化抗體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，通過同位素標(biāo)記，多維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析在傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子，對這些蛋白進行分離純化；用分離純化出來的傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子對6-8周齡的雌性BALB/c小白鼠進行免疫，如果抗體滴度在1∶15000以上時，可將免疫小白鼠脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸液與對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞融合并篩選，得到分泌傳染病細(xì)胞中特異表達的細(xì)胞因子的人源化抗體的雜交瘤細(xì)胞；向6-8周齡的BALB/c小白鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，注射細(xì)胞后15天左右收集腹水，protein？G/A柱子純化腹水，獲得純度較高的治療傳染病細(xì)胞因子的人源化抗體。
【IPC分類】C07K16/24
【公開號】CN105218671
【申請?zhí)枴緾N201510649970
【發(fā)明人】李艷華, 張振剛
【申請人】李艷華
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年9月29日