一種酶法制備絲素/彈性蛋白復(fù)合膜材料的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶法制備絲素/彈性蛋白復(fù)合膜材料的方法，特別是一種利用β-酪氨酸酶進(jìn)行絲素中氨基酸轉(zhuǎn)化，借助于酪氨酸酶催化絲素與彈性蛋白交聯(lián)，制備復(fù)合絲素膜材料的方法，屬于紡織生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]源于桑蠶絲的絲素蛋白有良好的生物相容性，以其為原料加工的絲素蛋白膜在醫(yī)用組織工程材料構(gòu)建中有較廣泛的用途。彈性蛋白是一種高度交聯(lián)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，極難溶于水，它主要由平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及軟骨細(xì)胞產(chǎn)生，在生物體內(nèi)可與微原纖維交聯(lián)形成彈性纖維，有著被動(dòng)伸縮的功能，賦予所在組織、器官以伸縮性和可逆的變形能力。作為一種具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ奶烊簧镔Y源，彈性蛋白有著其他合成高分子材料無法比擬的彈性、穩(wěn)定性和生物相容性，使其成為生物醫(yī)用材料領(lǐng)域中令人期待的組織工程支架。
[0003]為改善再生絲素蛋白膜材料的應(yīng)用性能，可采用絲素與彈性蛋白相結(jié)合的方式，構(gòu)建新型醫(yī)用再生絲素蛋白材料。絲素蛋白的改性方法包括化學(xué)交聯(lián)法、酶催化改性法、共混改性法等。不同絲素膜改性方法中，化學(xué)改性法應(yīng)用較廣泛，其基本原理是利用絲素蛋白中含有較多氨基、羥基等極性反應(yīng)性基團(tuán)的特點(diǎn)，借助于化學(xué)交聯(lián)劑(如戊二醛、多元羧酸等)使絲素大分子間發(fā)生交聯(lián)，或與外源功能性化合物發(fā)生接枝。這類方法在改善絲素膜性能的同時(shí)也存在一定的不足，如使用的交聯(lián)劑易產(chǎn)生有害物質(zhì)殘留，產(chǎn)生環(huán)境污染等。近年來，隨著生物技術(shù)在高分子材料改性中的研究日趨深入，以生物酶技術(shù)進(jìn)行絲素材料功能化改性的研究日益受到重視。
[0004]絲素蛋白結(jié)構(gòu)中，具有反應(yīng)性的氨基酸殘基包括絲氨酸、酪氨酸、天門冬氨酸和賴氨酸等。其中，絲氨酸和酪氨酸在絲素蛋白中含量較高，兩者分別含有醇羥基和酚羥基。相比而言，酪氨酸殘基的反應(yīng)性較高，在多酚氧化酶(漆酶或酪氨酸酶)的催化氧化下，其中的酚羥基能生成反應(yīng)性較強(qiáng)的多巴醌，進(jìn)一步引發(fā)與氨基或羥基化合物反應(yīng)。由于絲素蛋白中酪氨酸殘基分布于由疏水性較強(qiáng)的丙氨酸和甘氨酸組成的大分子鏈中，影響了酶促反應(yīng)的可及度，因此絲素酶法接枝的效率有待提升。β -酪氨酸酶能催化苯酚與含羥甲基的絲氨酸反應(yīng)生成L-酪氨酸，若借助于β -酪氨酸酶的催化作用，將絲素蛋白中含醇羥基的絲氨酸轉(zhuǎn)化成具有酚羥基結(jié)構(gòu)的酪氨酸，則可大大提升絲素材料的反應(yīng)性，實(shí)現(xiàn)基于酪氨酸酶催化條件下絲素與彈性蛋白交聯(lián)，制備復(fù)合蛋白膜材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種酶法制備絲素/彈性蛋白復(fù)合膜材料的方法，所得到的復(fù)合膜材料有較好的生物相容及良好彈性，可拓展其作為醫(yī)用材料的應(yīng)用范疇。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明利用酪氨酸酶進(jìn)行絲素中氨基酸轉(zhuǎn)化，增加絲素蛋白中酪氨酸殘基的數(shù)量；借助于酪氨酸酶催化氧化絲素與彈性蛋白交聯(lián)，提高絲素/彈性蛋白復(fù)合膜材料膜的性能，具體工藝與步驟如下:
[0007](I)絲素溶液制備:以溴化鋰或氯化鈣溶解桑蠶絲，制備絲素溶液；
[0008]處理工藝處方及條件:將桑蠶絲加入到溴化鋰或氯化鈣的水溶液體系中，在30?80°C溶解后將絲素溶液裝入透析袋，以去離子水中透析8?36小時(shí)后過濾，制得濃度為10?50g/L絲素溶液；
[0009](2) β -酪氨酸酶催化氨基酸轉(zhuǎn)化:在步驟(I)絲素溶液中添加β -酪氨酸酶和苯酚，催化絲素中絲氨酸轉(zhuǎn)化成酪氨酸；
[0010]處理工藝處方及條件:β -酪氨酸酶I?100U/ml、苯酸I?10g/L、磷酸卩比卩多醛O?5g/L、氯化銨O?5g/L，溫度20?60 °C，pH范圍6.0?9.0，處理I?48小時(shí)；處理結(jié)束后將絲素溶液以去離子水透析8?36小時(shí)；
[0011](3)酪氨酸酶催化絲素與彈性蛋白交聯(lián):在步驟⑵絲素溶液中添加酪氨酸酶，催化氧化絲素上酪氨酸與彈性蛋白反應(yīng)；
[0012]處理工藝處方及條件:酪氨酸酶I?100U/ml、彈性蛋白5?50g/L，溫度20?50°C，pH范圍6.0?8.0，處理I?24小時(shí)；
[0013](4)絲素/彈性蛋白復(fù)合膜成型:取步驟(3)反應(yīng)后溶液，通過延流使其在成型模具內(nèi)平整鋪展，在室溫下風(fēng)干成膜或在_50°C?_20°C條件下冷凍干燥成膜。
[0014]—種酶法制備絲素/彈性蛋白復(fù)合膜材料的方法，所述絲素溶液制備時(shí)選用溴化鋰溶液、溴化鋰-乙醇水溶液或氯化鈣-乙醇水溶液；所述β -酪氨酸酶、酪氨酸酶品種來源于動(dòng)物、植物或微生物。
[0015]本發(fā)明利用酪氨酸酶、酪氨酸酶的催化作用，使彈性蛋白在絲素蛋白分子表面接枝，構(gòu)建絲素復(fù)合膜材料，與傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)法制備絲素復(fù)合膜相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)占.V.
[0016](I)酶催化效率高，在利用β -酪氨酸酶催化絲素中氨基酸轉(zhuǎn)化、酪氨酸酶催化絲素與彈性蛋白交聯(lián)反應(yīng)中，酶催化效率高，酶制劑用量較少；
[0017](2)酶處理?xiàng)l件緩和，在低溫和近中性條件下制備絲素/彈性蛋白復(fù)合膜，具有能耗低、處理工藝安全的優(yōu)點(diǎn)，避免了化學(xué)交聯(lián)法反應(yīng)易造成環(huán)境污染、絲素膜生物安全性低等諸多方面的缺陷；
[0018](3)復(fù)合膜性能改善明顯，利用酶法構(gòu)建的絲素/彈性蛋白復(fù)合膜，不但具有良好的生物相容性，膜材料力學(xué)性能也得到了改善，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0019]采用β -酪氨酸酶、酪氨酸酶催化絲素和彈性蛋白交聯(lián)，制備復(fù)合膜材料，具體實(shí)施例如下:
[0020]實(shí)施例1
[0021](I)絲素溶液準(zhǔn)備:桑蠶絲加入到溴化鋰-乙醇-水(質(zhì)量比45:45:10)溶液中，60°C溶解后將絲素溶液裝入透析袋，在去離子水中透析24小時(shí)，期間每小時(shí)換I次水，透析后過濾得到20g/L的絲素水溶液；
[0022](2) β -酪氨酸酶催化氨基酸轉(zhuǎn)化:在步驟(I)絲素溶液中添加20U/ml β -酪氨酸酶、5g/L苯酚、磷酸吡哆醛2g/L和氯化銨2g/L，在45°C、pH7.5條件下處理40小時(shí)；處理結(jié)束后將絲素溶液以去離子水透析24小時(shí)；
[0023](3)酪氨酸酶催化絲素與彈性蛋白交聯(lián):在步驟(2)絲素溶液中添加10U/ml酪氨酸酶、10g/L彈性蛋白，在溫度30°C、pH7.0條件下處理12小時(shí)；
[0024](4)絲素/彈性蛋白復(fù)合膜成型:取步驟(3)反應(yīng)后的溶液，通過延流使其在聚四氟乙烯(PTFE)成型模具內(nèi)平整鋪展，在室溫下風(fēng)干成膜。
[0025]絲素/彈性蛋白復(fù)合膜試樣1:處理中未添加β -酪氨酸酶和酪氨酸酶；
[0026]絲素/彈性蛋白復(fù)合膜試樣2:處理中添加β -酪氨酸酶和酪氨酸酶；
[0027]經(jīng)上述工藝處理后，評價(jià)ΝΙΗ/3Τ3細(xì)胞在絲素/彈性蛋白復(fù)合膜培養(yǎng)基中浸漬24小時(shí)后的存活率，并測定復(fù)合膜的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率。結(jié)果表明，試樣I的ΝΙΗ/3Τ3細(xì)胞存活率為82%、斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率分別為5.0MPa,0.6% ;試樣2的細(xì)胞存活率為85%、斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率能分別達(dá)到6.3MPa、l.5%。
[0028]實(shí)施例2
[0029](I)絲素溶液準(zhǔn)備:桑蠶絲加入到到氯化鈣-乙醇-水(摩爾比1: 1:7)，70°C溶解后將絲素溶液裝入透析袋，在去離子水中透析30小時(shí)，期間每小時(shí)換I次水，透析后過濾得到15g/L的絲素水溶液；
[0030](2) β -酪氨酸酶催化氨基酸轉(zhuǎn)化:在步驟(I)絲素溶液中添加10U/ml β -酪氨酸酶、4g/L苯酚、磷酸吡哆醛lg/L和氯化銨lg/L，在溫度40°C、pH8.0條件下處理30小時(shí)；處理結(jié)束后將絲素溶液以去離子水透析24小時(shí)；
[0031](3)酪氨酸酶催化絲素與彈性蛋白交聯(lián):在步驟(2)絲素溶液中，添加8UM酪氨酸酶、8g/L彈性蛋白，在溫度30°C、pH7.0條件下處理20小時(shí)；
[0032](4)絲素/彈性蛋白復(fù)合膜成型:取步驟(3)反應(yīng)后溶液，通過延流使其在聚四氟乙烯(PTFE)成型模具內(nèi)平整鋪展，在_50°C冷凍干燥成膜。
[0033]絲素/彈性蛋白復(fù)合膜試樣3:處理中未添加β -酪氨酸酶和酪氨酸酶；
[0034]絲素/彈性蛋白復(fù)合膜試樣4:處理中未添加β -酪氨酸酶，添加酪氨酸酶；
[0035]絲素/彈性蛋白復(fù)合膜試樣5:處理中添加β -酪氨酸酶和酪氨酸酶；
[0036]經(jīng)上述工藝處理后，評價(jià)ΝΙΗ/3Τ3細(xì)胞在上述絲素/彈性蛋白復(fù)合膜培養(yǎng)基中浸漬24小時(shí)后的存活率，并測定復(fù)合膜的斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率。其中試樣3測得的ΝΙΗ/3Τ3細(xì)胞存活率為89%、斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率能分別達(dá)到1.9MPa、l.6% ;試樣4的細(xì)胞存活率為91 %、斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率能分別達(dá)到2.3MPa、2.8%;試樣5的細(xì)胞存活率為90%、斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率能分別達(dá)到3.1MPa,3.5%
[0037]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種酶法制備絲素/彈性蛋白復(fù)合膜材料的方法，特別是一種利用β-酪氨酸酶進(jìn)行絲素中氨基酸轉(zhuǎn)化，借助于酪氨酸酶催化氧化絲素與彈性蛋白交聯(lián)，制備復(fù)合絲素膜材料的的方法，具體工藝與步驟如下: (1)絲素溶液制備:以溴化鋰或氯化鈣溶解桑蠶絲，制備絲素溶液； 處理工藝處方及條件:將桑蠶絲加入到溴化鋰或氯化鈣的水溶液體系中，在30?80°C溶解后將絲素溶液裝入透析袋，以去離子水中透析8?36小時(shí)后過濾，制得濃度為10?50g/L絲素溶液； (2)β -酪氨酸酶催化氨基酸轉(zhuǎn)化:在步驟(I)絲素溶液中添加β -酪氨酸酶和苯酚，催化絲素中絲氨酸轉(zhuǎn)化成酪氨酸； 處理工藝處方及條件:β -酪氨酸酶I?100U/ml、苯酸I?10g/L、磷酸卩比卩多醛O?5g/L、氯化銨O?5g/L，溫度20?60°C，pH范圍6.0?9.0，處理I?48小時(shí)；處理結(jié)束后將絲素溶液以去離子水透析8?36小時(shí)； (3)酪氨酸酶催化絲素與彈性蛋白交聯(lián):在步驟(2)絲素溶液中添加酪氨酸酶，催化氧化絲素上酪氨酸與彈性蛋白反應(yīng)； 處理工藝處方及條件:酪氨酸酶I?100U/ml、彈性蛋白5?50g/L，溫度20?50°C，pH范圍6.0?8.0，處理I?24小時(shí)； (4)絲素/彈性蛋白復(fù)合膜成型:取步驟(3)反應(yīng)后溶液，通過延流使其在成型模具內(nèi)平整鋪展，在室溫下風(fēng)干成膜或在_50°C?_20°C條件下冷凍干燥成膜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述絲素溶液制備時(shí)選用溴化鋰溶液、溴化鋰-乙醇水溶液或氯化鈣-乙醇水溶液；所述β -酪氨酸酶、酪氨酸酶來源于動(dòng)物、植物或微生物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法制備絲素/彈性蛋白復(fù)合膜材料的方法，應(yīng)用β-酪氨酸酶進(jìn)行絲素中氨基酸轉(zhuǎn)化，增加絲素蛋白中酪氨酸殘基的數(shù)量，繼而借助于酪氨酸酶催化氧化絲素與彈性蛋白交聯(lián)，制備出絲素/彈性蛋白復(fù)合膜。具體步驟如下：(1)絲素溶液制備；(2)添加β-酪氨酸酶、苯酚，催化絲素中絲氨酸轉(zhuǎn)化成酪氨酸；(3)絲素溶液中添加酪氨酸酶，催化氧化絲素上酪氨酸殘基與彈性蛋白反應(yīng)；(4)絲素/彈性蛋白風(fēng)干成膜或冷凍干燥成膜。與傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)法制備功能型絲素膜相比，本發(fā)明酶催化效率高、酶處理?xiàng)l件緩和、復(fù)合膜性能改善明顯；酶法構(gòu)建的絲素/彈性蛋白復(fù)合膜，不但生物相容性好，膜材料力學(xué)性能也得到改善。
【IPC分類】C08L89/00, C08J5/18, C08J3/24, C12P13/22
【公開號(hào)】CN105218842
【申請?zhí)枴緾N201510623198
【發(fā)明人】王平, 余圓圓, 鄧超, 王強(qiáng), 范雪榮
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年9月25日