一種提高水稻抗干旱、鹽害脅迫能力的內(nèi)生煙曲霉及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株內(nèi)生煙曲霉及其應(yīng)用，主要應(yīng)用于水稻對(duì)干旱和鹽害等非生物逆 境脅迫環(huán)境的耐受能力，實(shí)踐證明該煙曲霉可W用于提高水稻對(duì)上述非生物脅迫因素的抗 性。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（化yzasativa)原產(chǎn)亞洲熱帶，在中國(guó)廣為栽種后，逐漸傳播到世界各地。世 界上近一半人口，都W大米為食，故水稻的種植與生產(chǎn)對(duì)國(guó)計(jì)民生有重要影響。
[0003] 植物的內(nèi)生菌是一類在植物生活史中的某一階段生活于健康組織或器官內(nèi)部的 微生物，近年來(lái)的研究表明，內(nèi)生菌在協(xié)助寄主植物抵抗各種脅迫環(huán)境中扮演著十分重要 的角色，如病害、干旱、高鹽等生物因素或非生物因素引起的氧化脅迫。由于自然界的內(nèi)生 真菌的生物多樣性極為豐富，提供了豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物及生物活性類物質(zhì)，對(duì)工農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)、人類健康具有重要的價(jià)值，因而具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0004] 煙曲霉屬于半知菌類真菌，本菌主要存在于谷物、污染的食品、±壤和霉腐物中， 或寄藏于種子上，能引起人、畜和禽類的肺曲霉病及其他疾病，可侵染棉鈴和蘋(píng)果等，引起 果實(shí)腐爛。本菌能產(chǎn)生煙曲棒麥角素（fumigaclavines)、煙曲霉震顫素（fumitremorgins)， 煙曲霉素（fumigillin)、煙曲霉毒素（fumitoxins)、痛抱青霉原（verruculogen)等多種次 生代謝產(chǎn)物，但關(guān)于煙曲霉對(duì)植物的促生作用，目前國(guó)內(nèi)外還鮮有報(bào)道。 陽(yáng)0化]本發(fā)明從疏花水柏枝（MyricariaIaxiflora)根中分離得到一株內(nèi)生煙曲霉，它 能很好地提高水稻對(duì)干旱及鹽害的抗性，可服務(wù)于水稻的種植與生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的之一是提供一種煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17菌株，該煙 曲霉能很好地提高水稻的抗性，可用于水稻抗干旱和鹽害脅迫方面，為開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)的水稻提 供了新方向。
[0007] 所述煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17 是從疏花水柏枝（Myricaria Laxiflora)的根中獲得的內(nèi)生真菌，于2015年5月11日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、， 保藏編號(hào)為：M2015286。保藏地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。
[0008] 本發(fā)明煙曲霉（AspergillusfumigaUis)SG17在PDA培養(yǎng)基上具有W下微生物學(xué) 特性：菌落開(kāi)始為白色，經(jīng)2-3日后轉(zhuǎn)為藍(lán)綠色，但邊緣仍為白色，日久培養(yǎng)后變?yōu)樯罹G色、 煙綠色。初為絨狀或絮狀，隨著時(shí)間的推移變?yōu)榉勰睿吘壊糠忠渤霈F(xiàn)顏色，背面無(wú)色或 帶點(diǎn)黃褐色。僅上半部產(chǎn)圓筒形分生抱子，顏色為深淺不同的綠色，分生抱子梗光滑，頂囊 為燒瓶狀。
[0009] 本發(fā)明目的是提供一種用于提高水稻對(duì)干旱和鹽害脅迫抗性的菌劑和生物改良 劑，其活性成分為煙曲霉SG17。脅迫試驗(yàn)表明，煙曲霉SG17能提高水稻的廣譜抗性。本領(lǐng) 域技術(shù)人員很容易想到將本發(fā)明菌株的發(fā)酵液或發(fā)酵液提取物作為提高水稻抗性的有效 成分用于水稻抵抗干旱和鹽害脅迫。因而，本發(fā)明還包括含有所述菌株或者其發(fā)酵產(chǎn)物的 生物改良劑。
[0010] 本發(fā)明W煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17的DNA為模板，上游引物口Sl: 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3 '，下游引物口S4 :5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '，進(jìn)行菌 落PCR擴(kuò)增，獲得560bp的18SrDNA部分序列（SEQIDNO:1)。通過(guò)Blast與GenBank收 錄的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SG17與煙曲霉的同源性為100%。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為本發(fā)明的煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17的菌落形態(tài)。
[0012] 圖2為本發(fā)明的煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17的顯微形態(tài)。
[0013] 圖3為本發(fā)明的煙曲霉（Aspergillusfumiga化s)SG17菌體提高水稻抗干旱脅迫 作用效果。其中，A.脅迫前，B.干旱+SG17，C.干旱，化干旱+脯氨酸，E.空白。脯氨酸溶 液濃度為5Xl〇5m〇l/l空白為自來(lái)水。
[0014] 圖4為本發(fā)明的煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17菌體提高水稻抗鹽害脅迫 作用效果。其中，F(xiàn).脅迫前，G.鹽害+SG17，H.鹽害，I.鹽害+脯氨酸，J.空白，脯氨酸溶 液濃度為5X10 5m〇l/l空白為自來(lái)水。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例一：煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17的分離和保存
[0016] 2012年在=峽流域湖北宜昌境內(nèi)姻脂巧采集疏花水柏枝根，表面消毒后接種于加 工作濃度為25yg/ml青霉素的PDA固體培養(yǎng)基分離真菌。
[0017] 表面消毒：取疏花水柏枝根用自來(lái)水沖洗5次，無(wú)菌濾紙擦干后，75 %酒精浸泡 Imin,無(wú)菌水沖洗3次，再用3 %次氯酸鋼浸泡60S，然后用無(wú)菌水沖洗5次，無(wú)菌濾紙洗干 根表面水分。
[0018] 培養(yǎng)：用無(wú)菌剪刀將表面消毒后的根剪成0. 5*0. 5cm大小，接種于加工作濃度為 25yg/ml青霉素PDA固體培養(yǎng)基（馬鈴馨200g/L、葡萄糖20g/l、瓊脂20邑/1、化6. 0-6. 5)， 置于28 °C下培養(yǎng)。
[0019] 菌株純化：待平板上長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)形態(tài)挑取單菌落接種于新的PDA固體培養(yǎng) 基中，置于28°C下培養(yǎng)。
[0020] 菌株保藏：待菌株純化后，挑取純菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)4d，用滅 菌的液體石蠟封藏于4°C保藏。
[0021] 將該菌株煙曲霉（Aspergillusfumiga化S)進(jìn)行保藏，保藏名稱為SG17 ;保藏單 位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、；保藏地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)；保藏日期：2015年5月11 日；保藏編號(hào)為，M2015286。
[0022] 實(shí)施例二：煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17 鑒定
[0023] 菌株的形態(tài)特征和顯微特征見(jiàn)附圖1.。
[0024] 18SrDNA序列分析：采用通用引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增18SrDNA序列。上游引物 ITS1 :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3'，下游引物口S4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。反 應(yīng)體系如下：
[0026]反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性lmin，56°C退火 30sec，72°C延伸l.min，33 個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，挑取750bp左右的條 帶進(jìn)行凝膠回收，送上海生工測(cè)序。
[0027] 將測(cè)得的序列提交至GenBank,并獲得登錄號(hào)KR812470。
[0028]實(shí)施例S:煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17 菌體的制備
[0029] 菌體制備：取保存4°C冰箱的煙曲霉種劃線接種于PDA平板中，28°C下，培養(yǎng)4山獲 得菌體。
[0030] 發(fā)酵液制備：用打孔器在上述菌落培養(yǎng)基平板上打取1個(gè)菌餅置于含100mLPDA 液體培養(yǎng)基的500ml的=角錐形瓶中，搖勻，然后置于28°C搖床振蕩培養(yǎng)（120rpm)，獲得發(fā) 酵液。
[0031] 實(shí)施例四：煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17菌體提高水稻抗干旱脅迫能力 作用
[0032] 水稻幼苗制備：將從4°C冰箱中取出的日本晴種子置于自來(lái)水中浸泡4山促使其 生根發(fā)芽，并每隔1化更換一次水。4d后將其種植在盛裝有±壤的塑料杯中，定期誘水，7d 后即可獲得水稻日本晴幼苗。
[0033] 干旱脅迫試驗(yàn)：將發(fā)酵液超聲波破壁化后加入到日本晴幼苗中得到實(shí)驗(yàn)組，用 5X105mol/l脯氨酸溶液代替發(fā)酵液為正對(duì)照組，自來(lái)水為空白組，不補(bǔ)充任何物質(zhì)為干旱 脅迫，每組做=個(gè)平行，將上述幼苗放置25-3(TC的室溫下培養(yǎng)。脅迫開(kāi)始前一天向各幼苗 充分誘水，在脅迫期間只定量向空白組補(bǔ)充水分，共脅迫12天。
[0034] 實(shí)施例五：水稻干旱脅迫后幼苗生理指標(biāo)檢測(cè)
[0035] 丙二醒含量：植物在逆境下遭受傷害與活性氧積累誘發(fā)的膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用密切 相關(guān)，膜脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物有脂質(zhì)過(guò)氧化物、丙二醒、乙燒等，其中丙二醒是最重要的產(chǎn)物 之一。因此可通過(guò)測(cè)定丙二醒含量了解膜脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，W間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度 W及植物的抗逆性。利用南京建成生物工程研究所的植物丙二醒測(cè)定試劑盒測(cè)定丙二醒含 量。
[0036] 脯氨酸含量：在正常環(huán)境條件下生長(zhǎng)的植物，體內(nèi)游離脯氨酸的含量較低；但在 逆境條件下，植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量可顯著增加。脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠 體及組織內(nèi)的代謝過(guò)程。因此，游離脯氨酸的含量可作為植物抗逆性的指標(biāo)。利用南京建 成生物工程研究所的脯氨酸測(cè)試盒測(cè)定脯氨酸含量。
[0037] 干旱脅迫后丙二醒及脯氨酸的檢測(cè)結(jié)果
[0038] 表一干旱后水稻丙二醒含量
[0040] 表二干旱后水稻脯氨酸含量
陽(yáng)042] 表1. 2中的正對(duì)照是為5XIO-SmoVl脯氨酸溶液，空白為自來(lái)水。
[0043] 實(shí)施例六：煙曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17菌體提高水稻抗鹽害脅迫能力 作用 W44] 水稻幼苗制備：將從4°C冰箱中取出的日本晴種子置于自來(lái)水中浸泡4山促使其 生根發(fā)芽，并每隔1化更換一次水。4d后將其種植在盛裝有±壤的塑料杯中，定期誘水，7d 后即可獲得水稻日本晴幼苗。
[0045] 鹽害脅迫試驗(yàn)：將發(fā)酵液超聲波破壁化后加入到日本晴幼苗中得到實(shí)驗(yàn)組，用 5X10 5mol/l脯氨酸溶液代替發(fā)酵液為正對(duì)照組，自來(lái)水為空白組，不補(bǔ)充任何物質(zhì)為干 旱脅迫，每組做=個(gè)平行，將上述幼苗放置25-3(TC的室溫下培養(yǎng)。脅迫開(kāi)始前一天向?qū)嶒?yàn) 組及正對(duì)照組中充分加入7. 5g/LNaCl溶液，在脅迫期間定量向各幼苗補(bǔ)充水分，共脅迫12 天。
[0046]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 煙曲霉)SG17,于2015年5月11日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏編號(hào)為：M2015286。2. -種用于提高水稻抗干旱及鹽害脅迫的改良劑，其活性成分為煙曲霉。3. -種生物改良劑，其含有權(quán)利要求1的煙曲霉。4. 權(quán)利要求1所述的煙曲霉、權(quán)利要求2所述的改良劑或權(quán)利要求3所述的生物改良 劑在提高水稻抗干旱及鹽害脅迫中的應(yīng)用，其逆境脅迫為干旱及鹽害。5. 權(quán)利要求1所述的煙曲霉或權(quán)利要求2所述的生物改良劑在提高水稻抗干旱及鹽害 脅迫能力中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中所述的生物改良劑提高水稻對(duì)干旱及鹽害脅迫的抗 性。7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的煙曲霉，該煙曲霉自疏花水柏枝的根中分離得到。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種煙曲霉及其應(yīng)用。該煙曲霉保藏名稱為<i>Aspergillus</i><i>？fumigatus？</i>SG17；保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)；保藏日期：2015年5月11日；保藏編號(hào)為M？2015286。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，煙曲霉菌體能提高水稻的對(duì)干旱和鹽害脅迫的抵抗能力，不僅可以提高水稻在上述非生物脅迫條件下的生長(zhǎng)，同時(shí)為篩選具有新型抗脅迫活性物質(zhì)的微生物奠定了良好的基礎(chǔ)，具有很好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。CCTCC NO：M 201528620150511
【IPC分類】C12N1/14, A01P21/00, A01N63/04, C12R1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105219651
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510504330
【發(fā)明人】劉士平, 蔣維, 孔玉珊, 秦王閣閣, 李淵韜, 薛艷紅, 高媛
【申請(qǐng)人】三峽大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2015年8月17日