用于木糖發(fā)酵制氫的菌株及制氫方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于木糖發(fā)酵制氨技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于木糖發(fā)酵制氨的菌株及其制氨方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] &作為一種環(huán)境友好的可再生的清潔新能源已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注和深入研 究。氨氣的制備方法中，生物制氨技術(shù)W可再生的生物質(zhì)原料來制取清潔能源氨氣，是最有 前景的制氨技術(shù)。相對于光解水制氨和光合細菌制氨，暗發(fā)酵制氨不需要提供光源，反應(yīng)器 簡單，底物利用范圍廣泛，可W利用能源作物或者是農(nóng)業(yè)廢棄物作為發(fā)酵底物。
[0003] 暗發(fā)酵制氨是利用產(chǎn)氨微生物轉(zhuǎn)化生物質(zhì)的生物制氨技術(shù)，目前已知的暗發(fā) 酵產(chǎn)氨細菌主要有；腸桿菌巧nterobacter sp.)、芽抱桿菌度acillus sp.)和梭菌 (ClostridiumSP.)。但是大多數(shù)的研究都集中在梭菌和腸桿菌。目前發(fā)酵產(chǎn)氨的底物來 源主要有葡萄糖和淀粉等糧食作物，為了避免發(fā)生與人爭糧的現(xiàn)象，同時踐行變廢為寶的 理念，工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)廢棄物或市政餐廚垃圾等高有機質(zhì)含量的廢棄物成為了發(fā)酵產(chǎn)氨的 底物，送些底物在單一菌種或者混合微生物菌群的作用下被降解。但是地球上含量最豐富 的纖維素類物質(zhì)由于其中含有的木質(zhì)素的難生物降解性而成為纖維素類物質(zhì)開發(fā)使用的 瓶頸。
[0004] 木質(zhì)纖維素中含有35% -45%的纖維素、25% -40%的半纖維素（己糖和木糖的雜 聚物）和20% -35%的木質(zhì)素。木質(zhì)纖維素經(jīng)水解后的產(chǎn)物主要有葡萄糖和木糖，前者是 微生物菌種廣泛應(yīng)用的底物，但是能夠利用木糖的微生物種類少之又少。
[0005] 基于上述分析，本發(fā)明的發(fā)明人認為目前存在的問題是需要篩選出能夠使木糖降 解產(chǎn)氨的菌株，尤其是能夠使木糖降解并大量產(chǎn)氨的菌株W及利用所篩選的菌株進行木糖 發(fā)酵制氨的方法，W使得纖維素類物質(zhì)能夠完全被利用的同時得到大量的氨。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了用于木糖發(fā)酵制 氨的菌株，所述菌株為蠟樣芽抱桿菌Sl株和圓滑短波單胞菌Zl株，送些菌株是基于木糖 降解篩選獲得，具有較高的產(chǎn)氨能力。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種木糖發(fā)酵制氨方法，該方法W木糖為底物，采用蠟樣芽抱桿 菌Sl株和/或圓滑短波單胞菌Zl株進行發(fā)酵培養(yǎng)制氨，工藝簡單，產(chǎn)氨效率高，尤其是采 用菌株混合物進行發(fā)酵制氨時菌間具有很好的協(xié)同作用，產(chǎn)氨效率更高，可W用于工業(yè)化 生產(chǎn)。
[0008] 為此，本發(fā)明第一方面提供了一種用于木糖發(fā)酵制氨的菌株，其中，所述菌株為蠟 樣芽抱桿菌Sl株度acillus cereus, Strain SI),其保藏編號為；CGMCC NO. 9035,保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中必（簡稱；CGMCC ;地址；北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所），保藏日期：2014年4月11日。
[0009] 本發(fā)明第二方面提供了一種用于木糖發(fā)酵制氨的菌株，其中，所述菌株為圓滑 短波單胞菌Zl株度revundimonasnaejangsanensis,StrainZl),其保藏編號為；CGMCC NO. 9036,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中必（簡稱；CGMCC;地址；北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所），保藏日期：2014年4月11日。
[0010] 本發(fā)明第H個方面提供了一種木糖發(fā)酵制氨方法，包括將發(fā)酵菌種接種至發(fā)酵培 養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)的步驟，其中，所述發(fā)酵菌種由相應(yīng)的菌株經(jīng)過種子培養(yǎng)獲得。發(fā)酵菌 種包括菌種M和/或菌種N。
[0011] 制備菌種M相應(yīng)的菌株M為與本發(fā)明第一方面所述的蠟樣芽抱桿菌Sl株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株；優(yōu)選所述發(fā)酵菌株M為與本發(fā)明第一方面所述的蠟樣芽 抱桿菌Sl株的16SrRNA的同源性至少為95%的菌株；進一步優(yōu)選所述發(fā)酵菌株M為如本 發(fā)明第一方面所述的蠟樣芽抱桿菌Sl株。所述蠟樣芽抱桿菌Sl株的16SrRNA序列如序 列表中的SEQNO. 1所示。
[0012] 制備菌種N相應(yīng)的菌株N為與本發(fā)明第二方面所述的圓滑短波單胞菌Zl株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株；優(yōu)選所述發(fā)酵菌株N為與本發(fā)明第二方面所述的圓滑短 波單胞菌Zl株的16SrRNA的同源性至少為95%的菌株；進一步優(yōu)選所述發(fā)酵菌株N為如 本發(fā)明第二方面所述的圓滑短波單胞菌Zl株。所述圓滑短波單胞菌Zl株的16SrRNA序 列如序列表中的SEQNO. 2所示。
[0013] 正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，不同的微生物野外分離株在基因序列上有微小的變 異，然而，當變異不影響其蛋白質(zhì)合成、結(jié)構(gòu)或者主要作用功能區(qū)時，該微生物之他種野外 分離株即使基因序列無法百分之百相同，其基本的生理功能并不會有所改變。但是同源性 比較如果針對全部的基因來進行比對，實際上是非常巨大的工程，不太可行，目前國際上常 使用16S化bosomalRNA(16SrRNA)來進行細菌型的分辨，因此在相似性的比較上可W用 16SrRNA來進行比對而得到其同源性。所W本發(fā)明所使用的發(fā)酵菌株并不限定于本發(fā)明所 使用的野外分離株，16srRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列，存在于所 有細菌的染色體基因組中。16SrRNA具有高度的保守性和特異性W及該基因序列足夠長 (包含約50個功能域）。
[0014] 因此，本發(fā)明中，菌株M為與本發(fā)明第一方面所述的蠟樣芽抱桿菌Sl株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株。優(yōu)選菌株M為與第一方面所述的蠟樣芽抱桿菌Sl株的 16SrRNA的同源性至少為95%的菌株。進一步優(yōu)選的是，菌株M為如本發(fā)明第一方面所述 的蠟樣芽抱桿菌Sl株。即在不改變蠟樣芽抱桿菌Sl株的16SrRNA的前提下，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可W通過簡單的篩選或誘變本發(fā)明的蠟樣芽抱桿菌Sl株，獲得與本發(fā)明蠟樣芽抱桿 菌Sl株16SrRNA高度同源的菌株，并獲得相應(yīng)地具有相同或相似的木糖發(fā)酵產(chǎn)氨功能的 菌株種子液的混合物。
[0015] 類似地，本發(fā)明中，菌株N為與本發(fā)明第二方面所述的圓滑短波單胞菌Zl株的16S rRNA的同源性至少為90%的菌株。優(yōu)選菌株N為與第二方面所述的圓滑短波單胞菌Zl株 的16SrRNA的同源性至少為95%的菌株。進一步優(yōu)選的是，菌株N為如本發(fā)明第二方面所 述的圓滑短波單胞菌Zl株。即在不改變圓滑短波單胞菌Zl株的16SrRNA的前提下，本領(lǐng) 域技術(shù)人員可W通過簡單的篩選或誘變本發(fā)明的圓滑短波單胞菌Zl株，獲得與本發(fā)明圓 滑短波單胞菌Zl株16SrRNA高度同源的菌株，并獲得相應(yīng)地具有相同或相似的木糖發(fā)酵 產(chǎn)氨功能的菌株種子液的混合物。
[0016] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)步驟中，還包括收集發(fā)酵過程中所產(chǎn)生 的氣體的操作。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵培養(yǎng)為兼氧或厭氧發(fā)酵培養(yǎng)。優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)為厭氧發(fā) 酵培養(yǎng)。木糖發(fā)酵產(chǎn)氨必須是兼氧或厭氧發(fā)酵，如果采用有氧發(fā)酵就無法很好的實現(xiàn)產(chǎn)氨。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)為菌種游離發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵菌種W種子液的形式 接種到發(fā)酵培養(yǎng)基。所述種子液的接種的量W體積計為2% -30%。優(yōu)選所述種子液的接 種的量W體積計為10% -20%。
[0019]所述種子培養(yǎng)是將菌株接種至種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)后獲得含有菌種的種子液。在含 有菌種M的種子液中，菌種M的含量為0. 001-0.Ig/mL。在含有菌種N的種子液中，菌種N 的含量為 0. 001-0.Ig/mL。
[0020] 在本發(fā)明的一些實施例中，當發(fā)酵菌種為菌種M和菌種N時，在所接種的種子液 中，含有菌種M的種子液與含有菌種N的種子液的體積比為10 : 0.01-0.01 : 10。優(yōu)選 含有菌種M的種子液與含有菌種N的種子液的體積比為0.1 : 1-10 : 1。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明方法，所述發(fā)酵培養(yǎng)為菌種固定化發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵菌種W負載于載體 的形式接種到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明方法，所述載體包括吸附載體和包埋載體，所述吸附載體選自大孔樹 月旨、娃藻±、多孔玻璃、活性炭、木屑、陶瓷、沸石、絲瓜絡(luò)、枯桿、玉米芯和人工纖維材料中至 少一種；所述包埋載體選自海藻酸鋼、瓊脂、卡拉膠、聚丙帰醜胺凝膠和聚己帰醇凝膠中至 少一種。
[0023] 在本發(fā)明的一些實施例中，所述菌種在載體上的負載量為0. 010-0. 05g/g。
[0024] 在本發(fā)明的一些實施例中，負載有菌種的載體的接種量為2-lOg/L。
[0025]在本發(fā)明的一些實施例中，菌種負載于載體的操作，包括將菌株接種到分散有載 體的種子培養(yǎng)基中，在l〇-6(TC下，攬拌轉(zhuǎn)速在10-300巧m之間，培養(yǎng)24-10她，制得載有菌 種的載體，其中所述菌株包