一種胞內(nèi)生產(chǎn)克氏原螯蝦nadh脫氫酶亞基i蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種胞內(nèi)生產(chǎn)克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基I蛋白的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]如何實(shí)現(xiàn)無(wú)/弱副作用的人工卵巢發(fā)育調(diào)控一直是經(jīng)濟(jì)蝦蟹養(yǎng)殖的重要難題之一。目前人們雖已摸索出不少促蝦蟹卵巢快速成熟方法，如控溫、控光、強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)條件、激素處理等，但眼柄切除仍是不少蝦蟹人工育苗生產(chǎn)中促進(jìn)親蝦卵巢快速成熟及產(chǎn)卵的最常用、最有效方法。目前在蝦蟹繁殖季節(jié)，人工切除雌性蝦蟹的單側(cè)眼柄用以促進(jìn)卵巢同步發(fā)育、快速成熟，提高抱卵量，已在不少國(guó)家較為普遍應(yīng)用于多種海洋和淡水經(jīng)濟(jì)蝦蟹(如斑節(jié)對(duì)蝦、大西洋龍蝦、鋸緣青蟹等)的規(guī)?；B(yǎng)殖中。然而，應(yīng)用實(shí)踐中會(huì)出現(xiàn)無(wú)法避免的副作用:切除眼柄后易致親體蛻皮周期縮短、死亡率上升、卵子質(zhì)量下降等不良后果。眼柄切除誘導(dǎo)蝦蟹類卵巢快速發(fā)育成熟(簡(jiǎn)稱卵巢“眼柄切除效應(yīng)”)存在相似的分子機(jī)制，深入闡明該分子機(jī)制將非常有助于發(fā)掘到新的、更合理的人工生殖調(diào)控分子靶點(diǎn)，從而指導(dǎo)發(fā)展可替代眼柄切除、無(wú)/弱副作用的人工卵巢促熟思路和方法，對(duì)于經(jīng)濟(jì)蝦蟹類人工養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要價(jià)值?？耸显?下(Procambarus clarkii)，俗稱龍4下、小龍4下，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、十足目，是具較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一；同時(shí)，克氏原螯蝦還具有成本低、易飼養(yǎng)、體型較大易于實(shí)驗(yàn)操作等優(yōu)點(diǎn)，因此是研究蝦蟹類卵巢“眼柄切除效應(yīng)”分子機(jī)制的一種非常好的代表動(dòng)物。
[0003]NADH脫氫酶是線粒體內(nèi)膜上電子傳遞鏈的組成部分，含多個(gè)亞基，催化電子從NADH傳遞給輔酶Q，參與細(xì)胞能量代謝。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)NADH脫氫酶在克氏原螯蝦眼柄切除后的中期及晚期表達(dá)水平均逐漸提高，至卵巢發(fā)育至成熟期時(shí)(?15day)表達(dá)水平達(dá)到最高，與卵巢成熟標(biāo)志物vitellogenin動(dòng)態(tài)表達(dá)模式類似，表明其在克氏原螯4下“眼柄切除效應(yīng)”過(guò)程中具有重要功能。為深入探究NADH脫氫酶在克氏原螯蝦“眼柄切除效應(yīng)”誘導(dǎo)卵巢快速發(fā)育成熟中的作用和調(diào)控模式，首先需要制備大量高活性的NADH脫氫酶蛋白，并制備對(duì)應(yīng)單/多克隆抗體。本專利使用大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建高效表達(dá)克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基I蛋白的基因工程菌，為后續(xù)深入研究克氏原螯蝦卵巢“眼柄切除效應(yīng)”的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高效表達(dá)克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基I蛋白的基因工程菌，是將基因nadl導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)得到的基因工程菌。
[0005]所述基因nadl的序列是根據(jù)GeneBank中來(lái)源于克氏原螯4下(Procambarusclarkii)的Sequence ID:AFQ31571的序列進(jìn)行全基因化學(xué)合成得到。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述基因工程菌的構(gòu)建方法，成功高可溶性表達(dá)獲得了克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基I蛋白，其步驟如下:
[0007](I)設(shè)計(jì)引物 nadl-1:(5' -TCAGGAGGTACCATATTGGTTATAGTTGTT-Sr )和 nadl-2:(5' -ACTGAGGTCGACCTACAATACTAAAAATCAAGTA-3')，利用 PCR 將克氏原螯蝦 NADH 脫氫酶亞基I基因nadl的cDNA編碼框5’和3’兩側(cè)分別引入Kpn I和Sal I限制性酶切位點(diǎn)(下劃線顯示)；
[0008](2)通過(guò)雙酶切、分子連接等基因操作將nadl基因插入到表達(dá)質(zhì)粒pColdll，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pColdll-nadl ；
[0009](3)隨后將pColdll-nadl轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)，通過(guò)氨芐抗生素平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
[0010]本發(fā)明選取大腸桿菌冷休克表達(dá)載體pColdll，構(gòu)建了重組表達(dá)載體pColdll-nadl，利用大腸桿菌系統(tǒng)成功高可溶性表達(dá)獲得了克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基I蛋白，并對(duì)表達(dá)的NADH脫氫酶亞基I蛋白進(jìn)行了純化及免疫印跡分析。
[0011]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果:本發(fā)明首次以大腸桿菌為表達(dá)宿主實(shí)現(xiàn)了克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基I的高效重組表達(dá)，可溶性NADH脫氫酶亞基I蛋白的表達(dá)量約占表達(dá)株BL21(DE3)菌體總蛋白量的48%，大部分為可溶性狀態(tài)，目前國(guó)際上尚未見(jiàn)任何有關(guān)重組表達(dá)克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基I蛋白的報(bào)道。
【具體實(shí)施方式】
[0012]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
[0013]下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0014]在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0015]實(shí)施例1克氏原螯蝦nadl基因的獲得
[0016]根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已公開的克氏原螯4下nadl基因(Sequence ID:AFQ31571)序列進(jìn)行全基因化學(xué)合成。
[0017]實(shí)施例2克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基I的大腸桿菌重組表達(dá)、純化及免疫印跡鑒定
[0018](I)設(shè)計(jì)引物 nadl-Ι: (5' -TCAGGAGGTACCATATTGGTTATAGTTGTT-Sr )和 nadl-2:(5' -ACTGAGGTCGACCTACAATACTAAAAATCAAGTA-3')，利用 PCR 將克氏原螯蝦 nadI 基因的cDNA編碼框5’和3’兩側(cè)分別引入Kpn I和Sal I限制性酶切位點(diǎn)(下劃線顯示)，通過(guò)雙酶切、分子連接等基因操作將nadl基因插入到商業(yè)化表達(dá)質(zhì)粒pColdll，構(gòu)建重組質(zhì)粒pColdll-nadl ο隨后將pColdll-nadl轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)，通過(guò)氨芐抗生素平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，隨后利用IPTG進(jìn)行重組NADH脫氫酶亞基I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)基成分為:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化鈉(NaCl) 10g/L，pH 7.4。
[0019]誘導(dǎo)表達(dá)條件為:將重組表達(dá)質(zhì)粒pColdll-nadl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。含重組質(zhì)粒的工程菌在37°C條件下劇烈震蕩培養(yǎng)至OD6。。?0.5，隨后轉(zhuǎn)入15°C培養(yǎng)并加入終濃度為0.1mM的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)24h，轉(zhuǎn)速180rpm。收集菌體，SDS-PAGE分析全菌總蛋白顯示，基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達(dá)條帶，條帶分子量與預(yù)期大小分子量?34.5kD一致。在此條件下，重組蛋白的表達(dá)量約占菌體總蛋白量的48%，大部分為可溶性狀態(tài)。誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎菌體，利用Ni+柱親和層析法純化得到可溶性NADH脫氫酶亞基I蛋白，咪唑洗脫濃度為450mM。進(jìn)一步利用免疫印跡法對(duì)重組NADH脫氫酶亞基I進(jìn)行表達(dá)鑒定分析。上述相關(guān)方法均采用常規(guī)操作步驟。
[0020]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高效表達(dá)克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基I蛋白的基因工程菌，是將nadl基因?qū)隕.coli BL21(DE3)得到的基因工程菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述nadl基因的核苷酸序列如GeneBank 中 Sequence ID:AFQ31571 的序列所不。3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述基因工程菌的方法，其步驟如下:(1)設(shè)計(jì)引物nadl-Ι: (5 ' -TCAGGAGGTACCATATTGGTTATAGTTGTT-3 ')和 nadl-2:(5' -ACTGAGGTCGACCTACAATACTAAAAATCAAGTA-3')，利用 PCR 將克氏原螯蝦 NADH 脫氫酶亞基I基因nadl的cDNA編碼框5’和3’兩側(cè)分別引入Kpn I和Sal I限制性酶切位點(diǎn)； (2)通過(guò)雙酶切、分子連接等基因操作將nadl基因插入到表達(dá)質(zhì)粒pColdll，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pColdll-nadl ； (3)隨后將pColdll-nadl轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，通過(guò)氨芐抗生素平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證； 所述限制性酶切位點(diǎn)以加下劃線的字母表示。4.一種以權(quán)利要求1所述基因工程菌生產(chǎn)NADH脫氫酶亞基I蛋白的方法，其步驟如下:將重組表達(dá)質(zhì)粒pColdll-nadl轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。含重組質(zhì)粒的工程菌在37°C條件下劇烈震蕩培養(yǎng)至OD6。。?0.5，隨后轉(zhuǎn)入15°C培養(yǎng)并加入終濃度為0.1mM的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)24h，轉(zhuǎn)速180rpm。收集菌體，SDS-PAGE分析全菌總蛋白顯示，基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的特異表達(dá)條帶，條帶分子量與預(yù)期大小分子量?34.5kD 一致。在此條件下，重組NADH脫氫酶亞基I蛋白的表達(dá)量約占菌體總蛋白量的48%，大部分為可溶性狀態(tài)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)胞內(nèi)生產(chǎn)克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基I蛋白的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)全基因合成獲得nad1基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體pColdII-nad1并轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，為后續(xù)針對(duì)克氏原螯蝦卵巢“眼柄切除效應(yīng)”分子機(jī)制的深入研究奠定了重要基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N9/02, C12R1/19, C12N15/70, C12N15/53, C12N1/21
【公開號(hào)】CN105219688
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510650942
【發(fā)明人】管政兵, 水燕, 廖祥儒, 蔡宇杰, 陳康
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2015年10月10日