一種提高植物鉀吸收和耐鹽性的棉花基因GhHAK1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種提高植物鐘吸收和耐鹽性的 棉花基因化HAKl及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] ±壤鹽潰化問題已經(jīng)受到人們的高度重視。據(jù)統(tǒng)計，全球約有10億公頃的±地存 在不同程度的鹽潰化，而我國就有近一億公頃鹽潰化±地，我國華北地區(qū)就存在大片的鹽 潰化±地，其植物生長緩慢，作物產(chǎn)量很低。目前，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，工業(yè)污染的加劇，不合 理的灌概和施肥等原因，次生鹽潰化±壤面積也在逐年擴(kuò)大，使得農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán) 重阻礙。因此，改良利用、綜合治理鹽潰±地，培育耐鹽新品種W提高植物耐鹽性已成為農(nóng) 業(yè)及環(huán)境未來發(fā)展的重大課題。
[0003] 棉花是世界上最重要的天然纖維作物，也是蛋白、油脂的重要來源。正是因為棉花 纖維和種子與人類生活密切相關(guān)，成為世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。棉花的產(chǎn)量受很多因 素影響，其中鐘在棉花發(fā)育過程中參與許多重要生理生化過程的調(diào)節(jié)，起著重要作用。研究 表明棉花在低鐘（在ymol/L范圍內(nèi)）脅迫下對鐘的吸收能力，與植物根細(xì)胞內(nèi)高親和鐘 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量及其與r的親和能力密切相關(guān)。當(dāng)棉花的生長處于低鐘環(huán)境時，植株會通過 激發(fā)體內(nèi)高親和性鐘轉(zhuǎn)運(yùn)體基因家族的表達(dá)來實現(xiàn)對環(huán)境的適應(yīng)，運(yùn)也是r饑餓脅迫應(yīng)答 機(jī)制的關(guān)鍵。棉花鐘營養(yǎng)主要來源于±壤，±壤中全鐘含量相對較高，但能夠被植物體吸收 和利用的有效鐘較低。尤其是隨著鐘肥投入的相對減少，±壤缺鐘面積和范圍正在逐年擴(kuò) 大，棉花缺鐘現(xiàn)象在許多植棉國家已越來越嚴(yán)重。鑒于此，利用棉花作物在鐘素吸收和利用 上的遺傳多樣性，從鐘高效棉花品種中篩選鐘吸收高效關(guān)鍵基因，培育適于種植在低鐘環(huán) 境和耐鹽潰環(huán)境的棉花新種質(zhì)，對緩解我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中±壤缺鐘和鹽潰化問題具有重要意 義。但是，到目前為止關(guān)于提高棉花作物對±壤鐘吸收性和耐鹽性基因的研究還未見相關(guān) 的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種提高植物鐘吸收和耐鹽性的棉花基因化HAKl及其應(yīng) 用，W有目的培育適于在鹽堿地和低鐘±壤環(huán)境種植的植物品種。
[0005] 本發(fā)明是通過W下方法實現(xiàn)的：一種提高植物鐘吸收和耐鹽性的棉花基因 化HAK1，其核巧酸序列如沈QIDNO: 1所示。
[0006] 所述的提高植物鐘吸收和耐鹽性的棉花基因化HAKl編碼蛋白，其氨基酸序列如 沈QIDNO:2所示。
[0007] 本發(fā)明還公開了含有所述的提高植物鐘吸收和耐鹽性的棉花基因化HAKl的載 體，優(yōu)選為pUC19-GhHAKl和地1121-GhHAKl。
[0008] 本發(fā)明提供的棉花基因化HAKl在培育植物提高鐘吸收和耐鹽性中可W得到應(yīng) 用。
[0009] 其具體的應(yīng)用為：一種鐘吸收率高和耐鹽性植物的培育方法，在棉花或擬南芥中 轉(zhuǎn)入核巧酸序列如SEQIDNO: 1或編碼蛋白如SEQIDN0:2所示的基因，將轉(zhuǎn)化后的植物 組織培養(yǎng)成鐘吸收率高和耐鹽性的植物。
[0010] 迂棉17號是迂寧省的經(jīng)濟(jì)作物研究所W配制的4084X4258雜交組合。經(jīng)多年定 向篩選而育成的棉花新品種，于2000年11月通過迂寧省農(nóng)作物品種審定委員會審定，審定 編號是迂農(nóng)審證字第583號。該品種株型較緊湊，呈塔形，果枝II式，莖桿粗壯，根系發(fā)達(dá)， 葉片較大，葉色深綠。生育期130d屬早熟類型，鈴期發(fā)育，霜前花率90%~95%。
[0011] 本發(fā)明通過植物基因工程技術(shù)，利用電子克隆及PCR技術(shù)，分離與鑒定棉花鐘吸 收率高和耐鹽相關(guān)基因化HAKl序列的信息，并通過浸花法將基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，經(jīng)過鐘吸 收和耐鹽表型鑒定證明轉(zhuǎn)基因植株的鐘吸收能力和耐鹽力明顯提高。本發(fā)明首次獲得了提 高鐘吸收和耐鹽功能的基因化HAKl，為通過雜交或轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高鐘吸收和耐鹽棉花新 品種提供了基礎(chǔ)，對提高在缺鐘±壤和鹽堿地棉花種植的產(chǎn)量具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會 意義。
【附圖說明】
[001引 圖1為化HAKl基因開放閱讀框擴(kuò)增結(jié)果，Ml:A-EcoT14Marker;1 :為PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物；M2 :DL2000Marker。
[0013] 圖2為本發(fā)明pUC19-GhHAKl重組質(zhì)粒的檢測結(jié)果，其中Ml:DL2000Marker;1 : pUC19-GhHAKl質(zhì)粒；2 :(1地2〇 ;3-4 :轉(zhuǎn)化子；M2 :A-EcoT14Marker。
[0014] 圖3為本發(fā)明地1121-GhHAKl重組質(zhì)粒的檢測結(jié)果，其中Ml:DL2000Marker;M2 : 入-EcoT14Marker;1 :酶切后地 1121-GhHAKl質(zhì)粒；2 :pBI121-GhHAKl質(zhì)粒。
[0015] 圖4為本發(fā)明化HAKl蛋白的亞細(xì)胞定位觀察，其中左側(cè)為可見光激發(fā)下的巧光觀 察，右側(cè)為紫外光激發(fā)下的細(xì)胞觀察。
[0016] 圖5為本發(fā)明W管家基因化iquitin為內(nèi)參基因?qū)Φ顽娞幚砘疶)正常處理（NT) 和高鹽處理（ST)的化HAKl基因表達(dá)分析，其中脅迫48小時后觀察葉片和根系中的表達(dá)變 化。
[0017] 圖6為本發(fā)明低鐘脅迫下的轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察。其中正常處理設(shè)為2. 5mM和 低鐘處理設(shè)為0. 〇5mM。
[0018] 圖7為本發(fā)明不同濃度化Cl脅迫下的轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察。其中化Cl濃度設(shè) 為OmM、lOOmM、150mM、200mM和 250mM。
[0019] 圖8為本發(fā)明在低鐘高鹽脅迫下的轉(zhuǎn)基因擬南芥生物量分析結(jié)果，其中WT為 Columbia型擬南芥；LI,L2和L3為轉(zhuǎn)化HAKl基因的Columbia型擬南芥。
[0020] 圖9為本發(fā)明低鐘脅迫下的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片和根中r含量分析結(jié)果。
【具體實施方式】
[0021]W下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例中所用的試驗材料、試劑等，如無特殊說明，均 可從商業(yè)途徑得到。W下實施例中的定量試驗，均設(shè)置=次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0022] 實施例I與提高植物鐘吸收和耐鹽性的棉花基因化HAKl的獲得
[0023] (1)棉花種植與低鐘脅迫：將迂棉17的種子硫酸脫絨后室溫浸種過夜，選擇發(fā)芽 整齊一致的種子播于裝有賠石的營養(yǎng)鉢中。當(dāng)棉苗長至第一片真葉展開時低鐘脅迫：當(dāng)棉 苗長至第一片真葉展開時低鐘脅迫：用含有0. 〇5mM(mmol)KCl的500血1/2化agland營養(yǎng) 液培養(yǎng)2周后，用于提取葉片總RNA和化HAKl基因的克隆。
[0024] 似RNA提取和反轉(zhuǎn)錄：取步驟（1)中低鐘脅迫的迂棉17的新鮮葉片0.5g，按照購 自北京奧萊博生物技術(shù)有限責(zé)任公司的RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒對棉花新鮮組織 進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄采，得到雙鏈CDNA(dsDNA)材料。
[00巧](3)cDNA的合成：利用雷蒙德氏棉（GossypiumraimondiiL.)全基因組獲得 化ttp://cgp.genomics,org.cn/page/species/index.jsp)。
[0026] 設(shè)計引物：
[0027]上游引物(ihHAKl-F:5' -ATGCCTACTGATGACTTCGTTCAAG-3'（見沈QIDN0:3)
[0028]下游引物(ihHAKl-R:5' -CTACAGCTCATAAGTCATGCCGGCC-3'（見沈QIDN0:4)。
[0029] 通過PCR技術(shù)擴(kuò)增得到目的基因序列。PCR反應(yīng)體系及程序如下：
[0030] PCR擴(kuò)增體系：
[0031] 目的片段 10戰(zhàn) ]OxPCR 緩沖液(含Mg2+) 2.0uL 2. SmMdNTPs 1.6uL TaqpiusDNA 聚介鵬(2.5UZuL) 0.2uL GhliAKl-Y (IOuM) !.OyL GhUAKl-R: (IOuM) i.OpL ddH.O !3.2uL
[003引混合后，向每管中加入15 y L礦物油。
[00對 PCR擴(kuò)增程序：
[0034] 95°C5 分鐘；
[0035] 95°C30 秒，50°C30 秒，72°C1 分鐘 4 個循環(huán)；
[0036] 95°C30 秒，58°C30 秒，72°C1 分鐘 25 個循環(huán)；
[0037] 72°C10 分鐘。
[003引擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。
[0039](4)將瓊脂糖電泳后回收的目的片段連接于pGEM-T載體，反應(yīng)體系如下：
[0040] CDNA 每L pGM-T 趙體(50ng/VL) 1 畔 T4DNA連接酶(3U/}止） U止 IOx連接緩沖液 IjiL
[0041] 姆踩O 邸L
[0042] 將上述混合液混勻后4°C連接過夜。
[0043] 5、篩選陽性克隆由生工生物工程上海（股份）有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN 軟件和在美國國立生物信息中屯、網(wǎng)站化ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行生物信息 學(xué)分析，得到化HAKl基因編碼蛋白的開放閱讀框（ORF)，長度為2316bp，其核巧酸序列如 SEQIDNo:l所示；該核巧酸序列編碼的蛋白，長度為771個氨基酸殘基，其氨基酸序列如 沈QIDNo:2所示。
[0044] 實施例2基因化HAKl蛋白的功能分析
[0045] W洋蔥表皮細(xì)胞為材料研究化HAKl所表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的分布（即化HAKl基因 所表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位研究）：
[004引 （1)設(shè)計引物序列：利用DNAMAN軟件設(shè)計PCR引物，序列如下：
[0047]上游引物(ihHAKl-F:5, -ATGCCTACTGATGACTT