一種超聲波輔助外源基因轉(zhuǎn)化酵母菌的方法
【專利說(shuō)明】-種超聲波輔助外源基因轉(zhuǎn)化酵母菌的方法 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及外源基因?qū)胛⑸锏姆椒?，尤其設(shè)及一種將構(gòu)建的含有外源基因的 質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌的高效超聲波轉(zhuǎn)化方法。 (二）【背景技術(shù)】
[0002] 膽固醇氧化酶在食品開(kāi)發(fā)、醫(yī)療保健、臨床檢測(cè)、生物農(nóng)藥等方面具有廣泛的應(yīng)用 價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)膽固醇氧化酶市場(chǎng)供應(yīng)短缺，都從國(guó)外進(jìn)口。隨著研究深入，它的市場(chǎng)范圍 也從最初的臨床診斷試劑擴(kuò)展到食品加工、制藥工業(yè)、生物化學(xué)和生物抗蟲等領(lǐng)域，產(chǎn)品需 求量越來(lái)越大。但是野生菌株達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)要求，故目前都集中在通過(guò)基因工程方法 來(lái)提高膽固醇氧化酶產(chǎn)量。而常規(guī)的基因工程方法要求有高端儀器設(shè)備，所用試劑昂貴且 大多對(duì)人體和環(huán)境有害，超聲波作為一種物理方法可W解決運(yùn)種不利。
[0003] 轉(zhuǎn)化是指受體菌直接從周圍環(huán)境中吸收供體菌游離的DNA片段，并整合入受體菌 基因中，從而獲得了供體菌部分遺傳性狀的過(guò)程。通?？山?jīng)過(guò)物理或者化學(xué)的方法來(lái)提高 轉(zhuǎn)化率。傳統(tǒng)的方法有化學(xué)促進(jìn)法，載體介導(dǎo)法和機(jī)械法等，運(yùn)些方法盡管得到廣泛應(yīng)用， 也取得不菲的成果，但是都有不同程度的缺陷。有的效率低下，有的過(guò)程繁冗，有的成本昂 貴，特別是一些細(xì)胞只對(duì)某一個(gè)或某幾個(gè)方法敏感。而物理方法是基于細(xì)胞膜的破壞來(lái)提 高通透性，不依賴于細(xì)胞型，因此更具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。超聲波是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞破壁技 術(shù)，被認(rèn)為是一種潛在的轉(zhuǎn)化方法。 (H)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種超聲波輔助外源基因轉(zhuǎn)化酵母菌的方法，該方法新穎、轉(zhuǎn)化條件 溫和、成本低、綠色環(huán)境，易于實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法，解決了現(xiàn)有方法轉(zhuǎn)化率低，細(xì)胞活力 低，易死亡等問(wèn)題。 陽(yáng)0化]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供一種超聲波輔助外源基因轉(zhuǎn)化酵母菌的方法，所述方法為：將攜帶外 源基因的表達(dá)質(zhì)粒與酵母菌感受態(tài)細(xì)胞懸液混合，加入二甲基亞諷構(gòu)成反應(yīng)液，調(diào)節(jié)反應(yīng) 液抑值至5. 0~6. 0,在28~32°C、超聲波場(chǎng)強(qiáng)200~500W的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化 反應(yīng)結(jié)束后，篩選獲得含外源基因的酵母菌的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；所述酵母菌感受態(tài)細(xì)胞懸液是 由酵母菌感受態(tài)細(xì)胞與冰預(yù)冷的Imol/L的山梨醇水溶液重懸而成。
[0007] 進(jìn)一步，所述二甲基亞諷在反應(yīng)液中體積終濃度為1-4%。
[0008] 進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在28~32°C、超聲波場(chǎng)強(qiáng)200~500W的條件下反應(yīng)10~ 30min〇
[0009] 進(jìn)一步，所述攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒中外源基因?yàn)槟懝檀佳趸富?，核巧?序列為沈QIDNO. 1所示。
[0010]
[0011] 進(jìn)一步，所述酵母菌為畢赤酵母菌（Pichiapasto;ris)GS115,購(gòu)自invitrogen公 司。
[0012] 進(jìn)一步，所述攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒與酵母菌感受態(tài)細(xì)胞懸液體積比為 1:40-55,所述酵母菌感受態(tài)細(xì)胞懸液中濕菌體含量為1XIO7~1X10 8個(gè)細(xì)胞/ml。
[0013] 進(jìn)一步，所述酵母菌感受態(tài)細(xì)胞按如下步驟制備：將酵母菌接種至YTO液體培養(yǎng) 基中，28~30°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取培養(yǎng)液W體積濃度10%的接種量接種到Y(jié)TO液體培養(yǎng)基 中，28~30°C培養(yǎng)至ODe。。= 1. 3~1. 5,在4°C、1500r/min條件下離屯、5-lOmin，收集濕菌 體；將濕菌體置于冰水預(yù)冷的裝有無(wú)菌水的無(wú)菌聚丙締管中，于4°C，12(K)r/min離屯、5min， 棄上清，重復(fù)操作2次（即加入無(wú)菌水重懸沉淀并離屯、，后一次無(wú)菌水體積用量為上一次的 50% )，再用冰預(yù)冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸，4°C，12(K)r/min離屯、5min， 棄上清，用冰預(yù)冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸，獲得酵母菌感受態(tài)細(xì)胞懸 液。
[0014] 進(jìn)一步，所述攜帶膽固醇氧化酶基因的表達(dá)質(zhì)粒為pPICZB-choB載體質(zhì)粒。
[0015] 本發(fā)明所述超聲波輔助外源基因轉(zhuǎn)化酵母菌的方法，具體按如下步驟進(jìn)行：
[0016] (1)酵母菌感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)和收集
[0017] 挑取酵母菌（優(yōu)選畢赤酵母菌GSl15)單菌落，接種在5mLYro液體培養(yǎng)基中， 30°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，再將培養(yǎng)液W體積濃度10%的接種量轉(zhuǎn)移到50mLYTO液體培養(yǎng)基中， 28-30°C培養(yǎng)到ODe。。= 1. 3~1. 5,4°C1500r/min離屯、5-lOmin，收集濕菌體；將濕菌體置 于冰水預(yù)冷含50mL無(wú)菌水的無(wú)菌聚丙締管，于4°C，12(K)r/min離屯、5min，棄上清，每管再 用50血的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸，4°C，120化/min離屯、5min，棄上清，再用25血 的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸，4°C，120化/min離屯、5min，棄上清，沉淀用2血的冰預(yù) 冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸，4°C，120化/min離屯、5min，棄上清，沉淀再用 200yL的冰預(yù)冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸，獲得酵母菌感受態(tài)細(xì)胞懸液；
[0018] (2)W酵母菌為宿主的基因轉(zhuǎn)化研究
[0019] 將酵母菌感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入體積終濃度1-4%的二甲基亞諷構(gòu)成反應(yīng)液，添 加攜帶膽固醇氧化酶基因的pPICZB-choB載體質(zhì)粒，在抑值至5. 0~6. 0、28~32°C、超聲 波場(chǎng)強(qiáng)200~500W下，經(jīng)超聲波作用進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，分別考察場(chǎng)強(qiáng)和處理時(shí)間等參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn) 化的影響；
[0020] (3)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選
[0021] 當(dāng)轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布到含80~120yg/mL的zeocine的YTO平板 上進(jìn)行篩選，28~30°C條件下培養(yǎng)3~4山得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；
[0022] (4)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定
[0023] 隨機(jī)選取轉(zhuǎn)化平板上的轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA，W其為模板，采用特異性引物進(jìn)行 PCR驗(yàn)證。所用引物：5' -TTCCATGGCCGATAGCCGGGCGAACAG-3' 和 5'-GCGAATTCTCACTGGATGT 〔664〔6464164-3'。？〇?反應(yīng)條件為：941：5111111;941：303,551：303,72°(：1111111，30個(gè)循環(huán)； 72°C5min;凝膠電泳檢測(cè)重組載體是否插入畢赤酵母基因組。
[0024] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：
[00巧]1)目前報(bào)道多集中在超聲誘導(dǎo)植物和動(dòng)物基因轉(zhuǎn)化，本發(fā)明擬W超聲波方法誘導(dǎo) 微生物基因轉(zhuǎn)化。
[00%] 2)常用的基因轉(zhuǎn)化方法有基因工程法和電穿孔法，基因工程法要求有高端儀器設(shè) 備，所用試劑昂貴且大多對(duì)人體和環(huán)境有害；電穿孔要求有較低的離子介質(zhì)和較高的電壓， 并且接合要求有直接細(xì)胞-細(xì)胞接觸。本發(fā)明所述超聲波誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化方法更加環(huán)保，不 依賴于細(xì)胞型，且轉(zhuǎn)化率和電轉(zhuǎn)化率相當(dāng)。當(dāng)前電轉(zhuǎn)化是主要轉(zhuǎn)化方法，本發(fā)明超聲波促進(jìn) 轉(zhuǎn)化不僅具有前述優(yōu)勢(shì)，而且轉(zhuǎn)化率與報(bào)道電轉(zhuǎn)化率較高的文獻(xiàn)相當(dāng)甚至超過(guò)，如王永興 的ECM830電穿孔儀在畢赤酵母電轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用（動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006,27(增）：82-84), 轉(zhuǎn)化效率約為3Xl(f/yg DNA，本發(fā)明轉(zhuǎn)化率達(dá)3. 5Xl(f/yg DNA。 (四）
【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1為實(shí)施例1陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選凝膠電泳圖，泳道M為Marker,泳道1為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化 子。
[002引圖2為實(shí)施例2陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選凝膠電泳圖，泳道M為Marker,泳道1為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化 子。
[0029] 圖3為實(shí)施例3陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選凝膠電泳圖，泳道M為Marker,泳道1為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化 子。 (五）
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此： 陽(yáng)03UYPD液體培養(yǎng)基配方為：酵母膏l(xiāng)Og，蛋白腺20g，葡萄糖20g，1000 ml水。
[0032] YPD平板配方為：酵母膏l(xiāng)Og，蛋白腺20g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，1000 ml水。 陽(yáng)〇3引 實(shí)施例1
[0034] (1)畢赤酵母菌感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)和收集
[0035] 挑取畢赤酵母菌（Pichiapasto;ris)GS115單菌落（購(gòu)自invitrogen公司），接種 至5mLYTO液體培養(yǎng)基中，28 °C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，W體積濃度10 %接種量再轉(zhuǎn)移到50mLYPD 液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)到ODe。。= 1. 3,將培養(yǎng)液在4°C、150化/min離屯、5-lOmin，收集濕菌 體。將濕菌體倒入到一個(gè)用冰水預(yù)冷的含50mL無(wú)菌水的無(wú)菌聚丙締管，于4°C，120化/min 離屯、5min，棄上清，每管再用50血的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸。4°C，120化/min離 屯、5min，棄上清，再用25血的冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸，4°C，120化/min離屯、5min， 棄上清。用2mL的冰預(yù)冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸。4°C，120化/min離屯、 5min，棄上清，再用200yL的冰預(yù)冷的Imol/L的山梨醇水溶液將菌體沉淀重懸，得待轉(zhuǎn)化 感受態(tài)宿主細(xì)胞懸液。
[0036] (2) W畢赤酵母菌為宿主的基因轉(zhuǎn)化研究
[0037] 將膽固醇氧化酶基因ChoB克隆到pPICZB-載體質(zhì)粒上。
[0038] 將含膽固醇氧化酶基因choB的pPICZB質(zhì)粒（質(zhì)粒濃度應(yīng)不小于70ng/JiL)與步 驟（1)獲得的細(xì)胞懸液（懸液中濕菌體含量為IXlO8細(xì)胞/mU^體積比為1:40混合，即 取8yL質(zhì)粒與320yL細(xì)胞懸液混合，再加入體積終濃度2 %的二甲基亞諷，置于轉(zhuǎn)化杯中， 抑調(diào)至5. 0 ;溫度調(diào)至28°C，超聲波場(chǎng)強(qiáng)為200W，處理時(shí)間為20min。
[0039] (3)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選 W40]當(dāng)轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液離屯、，收集濕菌體，加入SOOiiL冰預(yù)冷的Imol/L的山梨 醇水溶液將轉(zhuǎn)化后的菌體混勻，轉(zhuǎn)至1. 5mL的EP管中，30°C靜置培養(yǎng)比。將菌體懸液涂布 于含80yg/mLzeocine的YPD平板上，每100化，200化，300yL涂布一塊平板，平板在 28°C條件下培養(yǎng)4