一種藻酸鹽組成的微膠囊中合成胞外蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，尤其涉及一種由聚乙烯亞胺涂覆藻酸鹽組成的半透微膠囊中合成胞外蛋白質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]從分子水平上了解蛋白質(zhì)的功能是研究生物基因的關(guān)鍵，如今隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對蛋白質(zhì)表達純化技術(shù)的要求越來越高，但目前傳統(tǒng)應(yīng)用的細胞重組蛋白質(zhì)體系因其自身的局限與不足無法使研究達到理想狀態(tài)，于是無細胞蛋白質(zhì)系統(tǒng)應(yīng)運而生并得到快速發(fā)展。
[0003]無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)是一種以mRNA或DNA為模板，通過在細胞抽提物的酶系中補充底物和能源物質(zhì)來合成蛋白質(zhì)的體外系統(tǒng)。這一蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)能夠在沒有活體細胞存在的情況下進行連續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯來合成目標蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)的體內(nèi)重組表達系統(tǒng)相比，體外無細胞合成系統(tǒng)有其特殊的優(yōu)勢：1、大部分的能量和胞內(nèi)資源用于合成目標蛋白質(zhì)；2、蛋白質(zhì)合成的條件相對易控，可方便加入所需底物和催化劑，促進蛋白的表達和折置；3、用于表達有毒的蛋白質(zhì)，避免毒性蛋白對宿主細胞的致死作用；4、能在多孔板(如96孔板）上同時平行合成多種蛋白質(zhì)，滿足高通量藥物篩選和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需求；5、能直接以PCR產(chǎn)物作為模板合成蛋白質(zhì)，可進行突變蛋白的快速篩選，實現(xiàn)蛋白分子的體外定向進化；6、反應(yīng)體系靈活，可以與其它生物技術(shù)相偶聯(lián)，目的蛋白純化方便，有利于后續(xù)步驟的開展研究。
[0004]無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)應(yīng)用于（I)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)；（2)尚通量篩選和功能蛋白質(zhì)組學(xué)；（3)蛋白質(zhì)進化；（4)對蛋白質(zhì)進行特殊標記；（5)蛋白質(zhì)合成的微小化，無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)甚至可以達到納升的尺度，這是體內(nèi)蛋白質(zhì)合成無法想象的水平。但是無細胞系統(tǒng)不能進行共翻譯和翻譯后糖基化修飾，也不能進行其它真核蛋白的復(fù)雜修飾。無細胞蛋白合成系統(tǒng)試劑盒雖然使用方便，但是價格昂貴而且體系中的能量和底物都需要不斷地再生，目前還無法推廣到工業(yè)化生產(chǎn)。因此需要進一步的研究以降低成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種藻酸鹽組成的微膠囊中合成胞外蛋白質(zhì)的方法，以完善現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足。
[0006]為此，采用如下的技術(shù)方案，一種藻酸鹽組成的微膠囊中合成胞外蛋白質(zhì)的方法，其特征在于采取以下步驟：
A)在微流體裝置中分別注入外層水相、油相和內(nèi)層水相，流速分別為O. 01-0. 05, O. 1-0. 3和4-5mol/L ;所述外層水相是含I. 0wt%十二烷基甜菜堿的超純水，所述內(nèi)層水相是含I. 0wt%海藻酸鈉的超純水、O. 6wt%的氯化鈉和O. lwt%的熒光素葡聚糖的混合液；
B)調(diào)節(jié)內(nèi)層水相的滲透壓至200-500，在微管道的節(jié)點處形成水包油包水液滴； C)在載玻片上將步驟B)得到的水包油包水乳化液與包含0.05-0.5mol/L氯化鈣和0.05-0.5wt%聚乙烯亞胺的交聯(lián)溶液接觸，通過交聯(lián)反應(yīng)形成帶聚離子復(fù)合膜的海藻酸鈣小珠；
D)用大腸桿菌試劑盒中的酶和底物合成胞外蛋白質(zhì)，以試劑盒中的綠色熒光蛋白的DNA編碼為模板，DNA濃度為0.07-2ng/ μ L ；
Ε)將模板DNA、轉(zhuǎn)錄酶和翻譯酶及底物加入步驟Α)中的內(nèi)層水相，依次進行上述步驟A、B、C，得到半滲透微膠囊；
F)通過離心收集步驟E)得到的半滲透微膠囊，將含有底物的水相加入微膠囊懸浮液中，將微膠囊懸浮液置于培養(yǎng)皿中，在20-50°C下培養(yǎng)2-10小時使蛋白質(zhì)合成，然后在5-10°C下培養(yǎng)12-24小時使蛋白質(zhì)充分形成。
[0007]通過以上制備方法，本發(fā)明的有益效果是:(1)微膠囊由水包油包水微滴通過破裂誘導(dǎo)封裝方法制備，可減少被封裝材料的滲漏，并且制得的微膠囊有統(tǒng)一的粒徑分布；
(2)用綠色熒光蛋白編碼的模板DNA水溶液和合成胞外蛋白質(zhì)所需的酶由微流體裝置等分入水包油微滴，微滴轉(zhuǎn)化為半滲透微膠囊，通過檢測微膠囊中合成的綠色熒光蛋白質(zhì)中的熒光確認胞外蛋白質(zhì)的合成；(3)由聚乙烯亞胺涂覆的藻酸鹽組成的半透聚離子絡(luò)合物膜可使合成蛋白質(zhì)的底物順利擴散到微膠囊中，底物和副產(chǎn)物通過膜持續(xù)交換可使蛋白質(zhì)持續(xù)合成；(4)盡管由于微膠囊的體積小使得合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)物很少，但小分子副產(chǎn)物可透過半滲透膜分泌出去，蛋白質(zhì)仍保留在微膠囊中。
【具體實施方式】
[0008]實施例1采取以下步驟:
A)在微流體裝置中分別注入外層水相、油相和內(nèi)層水相，流速分別為0.01，0.1和4mol/L ;所述外層水相是含1.0wt%十—■燒基甜采喊的超純水，所述內(nèi)層水相是含1.0wt%海藻酸鈉的超純水、0.6wt%的氯化鈉和0.lwt%的熒光素葡聚糖的混合液；
B)調(diào)節(jié)內(nèi)層水相的滲透壓至200，在微管道的節(jié)點處形成水包油包水液滴；
C)在載玻片上將步驟B)得到的水包油包水乳化液與包含0.05mol/L氯化鈣和0.05wt%聚乙烯亞胺的交聯(lián)溶液接觸，通過交聯(lián)反應(yīng)形成帶聚離子復(fù)合膜的海藻酸鈣小珠；
D)用大腸桿菌試劑盒中的酶和底物合成胞外蛋白質(zhì)，以試劑盒中的綠色熒光蛋白的DNA編碼為模板，DNA濃度為0.07ng/ μ L ;
Ε)將模板DNA、轉(zhuǎn)錄酶和翻譯酶及底物加入步驟Α)中的內(nèi)層水相，依次進行上述步驟A、B、C，得到半滲透微膠囊；
F)通過離心收集步驟E)得到的半滲透微膠囊，將含有底物的水相加入微膠囊懸浮液中，將微膠囊懸浮液置于培養(yǎng)皿中，在20 °C下培養(yǎng)10小時使蛋白質(zhì)合成，然后在5 °C下培養(yǎng)24小時使蛋白質(zhì)充分形成。
[0009]實施例2采取以下步驟:
A)在微流體裝置中分別注入外層水相、油相和內(nèi)層水相，流速分別為0.03，0.2和4.5mol/L ;所述外層水相是含1.0wt%十二燒基甜菜喊的超純水，所述內(nèi)層水相是含1.0wt%海藻酸鈉的超純水、0.6wt%的氯化鈉和0.lwt%的熒光素葡聚糖的混合液； B)調(diào)節(jié)內(nèi)層水相的滲透壓至350，在微管道的節(jié)點處形成水包油包水液滴；
C)在載玻片上將步驟B)得到的水包油包水乳化液與包含0.3mol/L氯化鈣和0.3wt%聚乙烯亞胺的交聯(lián)溶液接觸，通過交聯(lián)反應(yīng)形成帶聚離子復(fù)合膜的海藻酸鈣小珠；
D)用大腸桿菌試劑盒中的酶和底物合成胞外蛋白質(zhì)，以試劑盒中的綠色熒光蛋白的DNA編碼為模板，DNA濃度為Ing/ μ L ;
Ε)將模板DNA、轉(zhuǎn)錄酶和翻譯酶及底物加入步驟Α)中的內(nèi)層水相，依次進行上述步驟A、B、C，得到半滲透微膠囊；
F)通過離心收集步驟E)得到的半滲透微膠囊，將含有底物的水相加入微膠囊懸浮液中，將微膠囊懸浮液置于培養(yǎng)皿中，在35°C下培養(yǎng)6小時使蛋白質(zhì)合成，然后在5°C下培養(yǎng)18小時使蛋白質(zhì)充分形成。
[0010]實施例3采取以下步驟:
A)在微流體裝置中分別注入外層水相、油相和內(nèi)層水相，流速分別為0.05，0.3和5mol/L ;所述外層水相是含1.0wt%十—■燒基甜采喊的超純水，所述內(nèi)層水相是含1.0wt%海藻酸鈉的超純水、0.6wt%的氯化鈉和0.lwt%的熒光素葡聚糖的混合液；
B)調(diào)節(jié)內(nèi)層水相的滲透壓至500，在微管道的節(jié)點處形成水包油包水液滴；
C)在載玻片上將步驟B)得到的水包油包水乳化液與包含0.5mol/L氯化鈣和0.5wt%聚乙烯亞胺的交聯(lián)溶液接觸，通過交聯(lián)反應(yīng)形成帶聚離子復(fù)合膜的海藻酸鈣小珠；
D)用大腸桿菌試劑盒中的酶和底物合成胞外蛋白質(zhì)，以試劑盒中的綠色熒光蛋白的DNA編碼為模板，DNA濃度為2ng/ μ L ;
Ε)將模板DNA、轉(zhuǎn)錄酶和翻譯酶及底物加入步驟Α)中的內(nèi)層水相，依次進行上述步驟A、B、C，得到半滲透微膠囊；
F)通過離心收集步驟E)得到的半滲透微膠囊，將含有底物的水相加入微膠囊懸浮液中，將微膠囊懸浮液置于培養(yǎng)皿中，在50 °C下培養(yǎng)2小時使蛋白質(zhì)合成，然后在10 °C下培養(yǎng)12小時使蛋白質(zhì)充分形成。
[0011]本發(fā)明的保護范圍并不限于以上幾個實施例，因此，凡是通過簡單的數(shù)值替換等形成的技術(shù)方案，均構(gòu)成本發(fā)明的具體實施例，并形成本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種藻酸鹽組成的微膠囊中合成胞外蛋白質(zhì)的方法，其特征在于采取以下步驟: A)在微流體裝置中分別注入外層水相、油相和內(nèi)層水相，流速分別為.0.01-0.05, 0.1-0.3和4-5mol/L ;所述外層水相是含1.0wt%十二烷基甜菜堿的超純水，所述內(nèi)層水相是含1.0wt%海藻酸鈉的超純水、0.6wt%的氯化鈉和0.lwt%的熒光素葡聚糖的混合液； B)調(diào)節(jié)內(nèi)層水相的滲透壓至200-500，在微管道的節(jié)點處形成水包油包水液滴； C)在載玻片上將步驟B)得到的水包油包水乳化液與包含0.05-0.5mol/L氯化鈣和.0.05-0.5wt%聚乙烯亞胺的交聯(lián)溶液接觸，通過交聯(lián)反應(yīng)形成帶聚離子復(fù)合膜的海藻酸鈣小珠； D)用大腸桿菌試劑盒中的酶和底物合成胞外蛋白質(zhì)，以試劑盒中的綠色熒光蛋白的DNA編碼為模板，DNA濃度為0.07-2ng/ μ L ； Ε)將模板DNA、轉(zhuǎn)錄酶和翻譯酶及底物加入步驟Α)中的內(nèi)層水相，依次進行上述步驟A、B、C，得到半滲透微膠囊； F)通過離心收集步驟E)得到的半滲透微膠囊，將含有底物的水相加入微膠囊懸浮液中，將微膠囊懸浮液置于培養(yǎng)皿中，在20-50°C下培養(yǎng)2-10小時使蛋白質(zhì)合成，然后在5-10°C下培養(yǎng)12-24小時使蛋白質(zhì)充分形成。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種藻酸鹽組成的微膠囊中合成胞外蛋白質(zhì)的方法，采取以下步驟：在微流體裝置中分別注入外層水相、油相和內(nèi)層水相；調(diào)節(jié)內(nèi)層水相的滲透壓，在微管道的節(jié)點處形成水包油包水液滴；在載玻片上將其與交聯(lián)溶液接觸；用大腸桿菌試劑盒中的酶和底物在合成胞外蛋白質(zhì)；通過離心收集半滲透微膠囊。通過以上制備方法，由聚乙烯亞胺涂覆的藻酸鹽組成的半透聚離子絡(luò)合物膜可使合成蛋白質(zhì)的底物順利擴散到微膠囊中，底物和副產(chǎn)物通過膜持續(xù)交換可使蛋白質(zhì)持續(xù)合成；盡管由于微膠囊的體積小使得合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)物很少，但小分子副產(chǎn)物可透過半滲透膜分泌出去，蛋白質(zhì)仍保留在微膠囊中。
【IPC分類】C12P21/00
【公開號】CN105219821
【申請?zhí)枴緾N201510720025
【發(fā)明人】劉建軍, 周夢青, 王秉
【申請人】浙江理工大學(xué)
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年10月30日