可避免假陰性的沙門氏菌恒溫?zé)晒鈾z測引物組、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種沙門氏菌的恒溫檢測引物組、試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門氏菌(sahiweWa)是一種常見的人獸共患病原菌，不僅引起各種動(dòng)物疾病，而且與人類多種疾病有關(guān)，其中，由沙門氏菌引起的食物中毒病例在食物中毒中居于前列。沙門氏菌屬的成員可感染多種動(dòng)物和人，大部分具有很強(qiáng)的致病性。沙門氏菌感染因其對人類、畜禽飼養(yǎng)業(yè)造成的危害，而被廣泛重視。
[0003]目前，包括我國在內(nèi)的許多國家對沙門氏菌的檢測普遍采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果大致需4?5天，加之檢測方法繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不僅成為檢驗(yàn)部門的一項(xiàng)沉重負(fù)擔(dān)，而且越來越不能滿足日益發(fā)展的國際貿(mào)易的需要。20世紀(jì)50年代以來，為了尋求快速、準(zhǔn)確、簡便、微量的檢測方法，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，從以傳統(tǒng)方法為基礎(chǔ)發(fā)展到以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的或以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的快速檢測方法，并在實(shí)踐檢驗(yàn)中不斷取得新進(jìn)展。
[0004]以抗體為基礎(chǔ)的ELISA方法和免疫熒光標(biāo)記方法將檢測時(shí)間縮短了一半，靈敏性高和但特異性差；以核酸為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)及恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于靈敏、簡單、快速和特異已被廣泛用于沙門氏菌檢測。但檢測樣品復(fù)雜，因目前檢測方法對假陰性的檢測結(jié)果沒有采取監(jiān)控手段，故存在漏檢的可能，但沙門氏菌危害嚴(yán)重，漏檢造成的危害無法估量，此外，PCR擴(kuò)增需要昂貴的儀器，很多基層檢測單位不具備相應(yīng)檢測條件。因此，建立一種可鑒別假陰性檢測結(jié)果的快速、高通量且對儀器要求不高的沙門氏菌檢測試劑盒及檢測方法成為目前急需解決的問題。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有檢測時(shí)間短，易于操作等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明在恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)基礎(chǔ)上加入內(nèi)標(biāo)基因，可提供一種有效鑒別檢測結(jié)果為假陰性檢測方法，有利于食品中沙門氏菌的準(zhǔn)確、及時(shí)發(fā)現(xiàn)，更加有利于恒溫檢測方法在檢測中的推廣應(yīng)用及提高檢測的準(zhǔn)確度。
[0005]本發(fā)明在樣品管檢測的時(shí)候同時(shí)設(shè)立一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因檢測管，該內(nèi)標(biāo)檢測管及檢測方法具有以下特點(diǎn):1)內(nèi)標(biāo)基因與實(shí)際樣品的檢測不在同一管中進(jìn)行檢測，2)該內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增靶標(biāo)與樣品檢測管中的擴(kuò)增靶標(biāo)不同，3)內(nèi)標(biāo)基因的擴(kuò)增靶標(biāo)的核酸濃度在該內(nèi)標(biāo)基因的檢測線附近，可識別輕微的反應(yīng)抑制。正常情況下因內(nèi)標(biāo)檢測管在加入樣品提取液的同時(shí)加入有低濃度的內(nèi)標(biāo)靶標(biāo)片段，所以內(nèi)標(biāo)檢測管檢測檢測結(jié)果為陽性，如內(nèi)標(biāo)管檢測結(jié)果為陰性，提示樣品提取液中含有抑制因子或其他原因，導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)檢測管不能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，同樣樣品檢測管也可能因抑制因子或其他原因?qū)е虏荒苓M(jìn)行正常擴(kuò)增檢測，造成樣品檢測管檢測結(jié)果為假陰性，因此該方法可根據(jù)內(nèi)標(biāo)管的檢測結(jié)果輔助判斷樣品檢測結(jié)果可能為假陰性結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種用于檢測沙門氏菌的恒溫?zé)晒庖锝M合物。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測試劑盒。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測方法。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
用于檢測沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測引物組合物，其包含一組檢測引物和一組內(nèi)標(biāo)引物，其中，所述檢測引物組包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示:
SP1-F3:5’ -TTTACGGTTCCTTTGACGG-3’ ；
SP1-B3:5’ -GCCCCATATTATCCGTATCG-3’ ；
SP1-FIP:5’ -AGTAGACAGGGCGGAGGACTATTGGCGGTATTTCGGTG-3’ ；
SP1-BIP:5’ -ACCATGCTGACCATTGGTGATGCGGCACTAATCGCAATCA-3’ ；
SP1-LF:5’ -AATCCATACCATGGCGAGTC-3’ ；
SP1-LB:5’ -GTCTTGTCGCCCAGATCC-3’。
[0010]所述內(nèi)標(biāo)引物組包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示:
SPF-F3:5’ -TGAGTGGCGGTACTATTCA-3’ ；
SPF-B3:5’ -GTGTTATCTGCCTGACCAG-3’ ；
SPF-FIP:5’ -GCCGTAAAGCTGGCGGTACACTAAATCCGCCGATCAA-3’ ；
SPF-BIP:5’ -GATTGGTGATACGACCGCACATTTCGGATCGCAGTCATTC-3’ ；
SPF-LoopF:5’ -TATTGACCCAACGTCACCG-3’ ；
SPF-LoopB:5’ -TGCCTTTCACCATCGTCC-3’。
[0011]一種沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測試劑盒，檢測試劑盒包括如上所述的檢測引物組和內(nèi)標(biāo)引物組。
[0012]作為優(yōu)選的，所述檢測引物組及內(nèi)標(biāo)引物組中，外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為:1_2:4_8:2_4。
[0013]作為優(yōu)選的，所述的沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測試劑盒中還包括以下成分:(1)反應(yīng)液；(2) DNA聚合酶；(3)內(nèi)標(biāo)靶標(biāo)片段；(4)陽性對照和陰性對照。
[0014]作為優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為feiDNA聚合酶。
[0015]作為優(yōu)選的，所述反應(yīng)液含有:10mM dNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、160mMMgSO4水溶液，三者的體積比是7:4:3。
[0016]作為優(yōu)選的，所述陽性對照為含有沙門氏菌SPI基因片段的T載體克隆，陰性對照為超純水，內(nèi)標(biāo)靶標(biāo)片段為含有沙門氏菌SPF基因片段的T載體克隆。
[0017]一種沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測方法，包括如下步驟:
(1)提取待檢樣品DNA；
(2)利用權(quán)利要求1的恒溫?zé)晒鈾z測引物組合物對待檢樣品DNA進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增；
(3)結(jié)果判斷:將反應(yīng)管中置于恒溫?zé)晒鈾z測儀或熒光PCR儀中，實(shí)時(shí)讀取熒光信號，根據(jù)SPI基因檢測結(jié)果和內(nèi)標(biāo)基因SPF檢測結(jié)果進(jìn)行判斷:
SPI基因檢測結(jié)果為陽性內(nèi)標(biāo)基因SPF檢測結(jié)果全為陽性時(shí)，檢測結(jié)果為陽性； SPI基因檢測結(jié)果為陰性內(nèi)標(biāo)基因SPF檢測結(jié)果全為陽性時(shí)，檢測結(jié)果為陰性；
SPI基因檢測結(jié)果為陽性內(nèi)標(biāo)基因SPF檢測結(jié)果全為陰性時(shí)，檢測結(jié)果為陽性；
SPI基因檢測結(jié)果為陰性內(nèi)標(biāo)基因SPF檢測結(jié)果全為陰性時(shí)，檢測結(jié)果可能為假陰性，建議重新提取DNA進(jìn)行檢測。
[0018]恒溫?cái)U(kuò)增的25 μ I 反應(yīng)體系含有:SP1-F3 0.2 μ M，SP1-B3 0.2 μ M，SPIFIP1.6 μΜ，SP1-BIP 1.6 μΜ，SP1-LF 0.8 μ Μ, SP1-LB 0.8 μ Μ, SPF-F3 0.2 μΜ，SPF -Β30.2 μ Μ，SPF-FIP 1.6 μ Μ，SPF-BIP 1.6 μ Μ，SPF-LoopF 0.8 μ Μ，SPF-LoopB 0.8 μ Μ，反應(yīng)液12.5 μ 1，DNA聚合酶8U，10 X SYBR Green I 0.5 μ 1，待檢樣品2 μ 1，內(nèi)標(biāo)2 μ 1，用超純水補(bǔ)齊到25 μ I。
[0019]恒溫?cái)U(kuò)增的程序?yàn)?63?65°C反應(yīng)30?45min，并在80°C持續(xù)2min。
[0020]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、成本低、不需要昂貴儀器、適合現(xiàn)場檢測等有益效果，更重要是該方法提高檢測的準(zhǔn)確性，及時(shí)發(fā)現(xiàn)檢測中的假陰性結(jié)果，可有效防止因假陰性檢測結(jié)果引起各種事故。
[0021](I)快速高效:整個(gè)擴(kuò)增只用30?45min即可完成，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)19?10 10個(gè)拷貝；
(2)操作簡便:不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部恒定溫度儀就能反應(yīng)和檢測，條件比較溫和；
(3)高特異性:本發(fā)明根據(jù)沙門氏菌SPI基因設(shè)計(jì)了六條特異性引物，應(yīng)用上述六條引物，擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū)域，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其特異性極高，且非常穩(wěn)定，形成引物二聚體概率低，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行；
(4)尚靈敏度:最低檢測極限可達(dá)到10fg/ μ I ；
(5)鑒定簡便:可通過觀察擴(kuò)增曲線判斷擴(kuò)增與否，無需電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場檢測。
[0022]( 6 )提