在疏水性相互作用位點(diǎn)內(nèi)引入了靜電相互作用的蛋白及其制備方法
【專利說明】在疏水性相互作用位點(diǎn)內(nèi)引入了靜電相互作用的蛋白及其 制備方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及具有高純度的異源雙特異性抗體度sAb)或雙特異性融合蛋白 度3巧）。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 大多數(shù)雙特異性抗體度sAb)均通過人工制造W同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同的祀標(biāo)，而不 是通常在自然界中產(chǎn)生。雙重祀向能力為BsAb提供了新的尚未被單特異性抗體（MsAb)設(shè) 足的應(yīng)用領(lǐng)域。對(duì)治療性目的的特別關(guān)注是引人深思的可能性，W使得BsAb(I)可靠地將 免疫細(xì)胞募集到祀細(xì)胞附近，（2)抑制或激活祀細(xì)胞中兩個(gè)相隔較遠(yuǎn)的信號(hào)傳導(dǎo)通路W產(chǎn) 生協(xié)同效應(yīng)，W及（3)W特異性和調(diào)控方式遞送福射誘導(dǎo)的治療性物質(zhì)、藥品、毒素或信號(hào) 傳導(dǎo)分子。
[000引 BsAb通常用于W非M肥依賴性方式將T細(xì)胞遞送到腫瘤細(xì)胞中，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞的細(xì)胞表面抗原與細(xì)胞毒性T細(xì)胞的CD3-TCR復(fù)合物之間的聯(lián)系（圖1)。圖1中的卡妥 索單抗(民6皿>^純?)(大鼠-小鼠混合單克隆抗體）用于治療惡性腹水，其稱為功能抗 體"。
[0004] 完整的鏈締合應(yīng)在兩個(gè)不同的水平上發(fā)生，W便產(chǎn)生修飾最少的全長(zhǎng)IgG樣的 BsAb,而無任何鏈締合問題。（1)兩條重鏈應(yīng)為異源雙特異性的，并且（2)兩條輕鏈化C)應(yīng) 與其相應(yīng)的重鏈正確配對(duì)。
[0005] 鏈締合問題應(yīng)加W解決W按值得信賴的方法產(chǎn)生BsAb。如圖2中所示，兩條重鏈 和兩條輕鏈的組合生成了 10個(gè)不同形式的抗體嵌合體。在它們之中，僅有一個(gè)是正確的 BsAb,而其余的是無價(jià)值的嵌合體。該鏈締合問題在工業(yè)領(lǐng)域中將正確的BsAb的產(chǎn)率降低 至至少10倍，并導(dǎo)致難W將BsAb與其他嵌合體分離的各種問題。因此，許多制藥公司花費(fèi) 了大量的資源并努力開發(fā)和獲得W直接且可靠的方式產(chǎn)生BsAb的技術(shù)。
[0006] 已開發(fā)了多種多樣的BsAb相關(guān)技術(shù)（45種不同的形式）。運(yùn)些技術(shù)基于結(jié)構(gòu)而 被分成4類。第一，通過包括稱為Knob-into-Hole或簡(jiǎn)稱為KiH的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性、靜電指向 效應(yīng)或C冊(cè)結(jié)構(gòu)域混編（稱為SE邸bodyTM)的各種方法對(duì)重鏈進(jìn)行的異源雙特異化；第二， 各種抗體片段形式，諸如Di油odyTM、BiTETM和DARTTM;第S，使用與完整抗體相結(jié)合的一 個(gè)或多個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域的技術(shù)，諸如ModularAntibodyTM、ZybodyTM、dAbsTM和DVD-IGTM; 第四，采用全長(zhǎng)IgG類似方案的技術(shù)，如DuobodyTM(F油-ArmExchange)、CrossMabTM、 AzymetricTM和klbodyTM,已得到開發(fā)。
[0007] 在它們之中，Zymeworks通過美國專利申請(qǐng)第2013-892198號(hào)（對(duì)在Fe結(jié)構(gòu)域中 具有突變的異源多聚體免疫球蛋白鏈的結(jié)構(gòu)專利提出了權(quán)利要求）表明異源多聚體結(jié)構(gòu) 的抗體可通過用帶電荷的氨基酸對(duì)二硫鍵中設(shè)及的半脫氨酸殘基進(jìn)行修飾而制備。
[0008] 然而，W上任何專利均未公開運(yùn)樣一種技術(shù)：選自疏水性相互作用部分的修飾氨 基酸對(duì)通過靜電相互作用而引起與彼此選擇性偶合。本發(fā)明人已通過確認(rèn)W下方面而完成 了本發(fā)明：當(dāng)將疏水性相互作用中設(shè)及的一對(duì)氨基酸分別修飾成酸性氨基酸和堿性氨基酸 時(shí)，異源雙特異化更具選擇性地發(fā)生。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[000引【技術(shù)問題】
[0010] 本發(fā)明的目的在于提供具有優(yōu)異的異源雙特異化的雙特異性抗體（異源二聚 體）。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種通過將疏水性相互作用中的一對(duì)氨基酸改變 成彼此相反的電荷而制造異源雙特異化很好地發(fā)生的蛋白的方法。
[001引【技術(shù)方案】
[0013] 對(duì)于W上目標(biāo)，本發(fā)明的第一方面是提供通過上述負(fù)電荷和上述正電荷而引入了 靜電相互作用的蛋白，其中一對(duì)疏水性氨基酸選自蛋白的疏水性相互作用的一部分，將一 個(gè)疏水性氨基酸改變成正電荷，并將另一個(gè)疏水性氨基酸改變成負(fù)電荷。帶有正電荷的材 料可W是堿性氨基酸但不限于此，帶有負(fù)電荷的材料可W是酸性氨基酸但不限于此。
[0014] 疏水性氨基酸是選自甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨 酸和苯丙氨酸中的任一種氨基酸，并且酸性氨基酸是選自天冬氨酸或谷氨酸的任一種氨基 酸。
[0015] 從兩個(gè)不同的肥/LC對(duì)來組裝全長(zhǎng)IgG類似的雙特異性抗體通過兩個(gè)鏈締合過程 進(jìn)行。換句話講，HC異源雙特異化和富有成效的HC/LC配對(duì)，及其在兩條重鏈之間的成功 率取決于區(qū)分重鏈與輕鏈的效率。
[0016] 為了找到適當(dāng)?shù)淖儺愇稽c(diǎn)，已關(guān)注了抗體的鏈之間的疏水性界面上的氨基酸殘 基，因?yàn)槭杷韵嗷プ饔檬堑鞍渍郫B和結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力。為了選擇如同疏水性相互作用 一樣強(qiáng)大的適當(dāng)類型的修飾（因?yàn)槠涮峁┙鉀Q雙特異性抗體的鏈締合問題所必需的蛋白 鑒別力），已選擇了靜電相互作用。
[0017] 據(jù)設(shè)想，此類鏈之間的區(qū)別通過在兩條結(jié)合鏈之間的界面處引入結(jié)構(gòu)修飾的互補(bǔ) 配對(duì)而解決。一個(gè)或多個(gè)疏水性氨基酸被突變的帶電荷的氨基酸替換W與對(duì)應(yīng)物配對(duì)。運(yùn) 樣的變化在下文中稱為S冊(cè)CAP(將疏水性置換成帶相反電荷的氨基酸對(duì)）。兩條重鏈的Fc 結(jié)構(gòu)域中的甜OCAP生成帶正電和帶負(fù)電的重鏈（各自稱為化和化）。運(yùn)些靜電相互作用 比重鏈的同源雙特異化（同源二聚化）更偏向于異源雙特異化（異源二聚化）。W相同的 方式，通過S冊(cè)CAP對(duì)兩個(gè)Fab結(jié)構(gòu)域的修飾形成帶正電和帶負(fù)電的輕鏈（分別稱為L(zhǎng)a和 化），并且與重鏈的帶相反電荷的Fab結(jié)構(gòu)域的靜電相互作用提高了正確HC/LC配對(duì)的概 率。
[0018]為了在無任何鏈締合問題的情況下產(chǎn)生BsAb，將兩個(gè)獨(dú)立的修飾引入天然存在的 抗體中。一個(gè)針對(duì)Fc結(jié)構(gòu)域的異源雙特異化，而另一個(gè)針對(duì)重鏈與輕鏈的正確配對(duì)。
[0019] 在本發(fā)明中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域的異源雙特異化（異源二聚化）在抗體的Fc結(jié)構(gòu)域中的 一個(gè)或多個(gè)疏水性相互作用轉(zhuǎn)化成靜電對(duì)相互作用（例如，第407位殘基處的兩個(gè)酪氨酸 的疏水性相互作用燈407:Y407)轉(zhuǎn)化成第407位殘基處天冬氨酸和賴氨酸的靜電對(duì)相互作 用值407:K407))時(shí)可靠且積極地發(fā)生。
[0020] 當(dāng)F油結(jié)構(gòu)域的主要疏水性殘基被置換時(shí)（例如，第128位殘基的亮氨酸和第118 位殘基的苯丙氨酸化128:F118)置換成第128位殘基的賴氨酸和第118位殘基的天冬氨酸 化128:0118))時(shí)，使用甜OCAP技術(shù)可較為容易地區(qū)分兩條重鏈（重鏈）和兩條輕鏈（輕 鏈）。因此，IgG類似的雙特異性抗體可通過將甜OCAP技術(shù)應(yīng)用于抗體的Fc和F油結(jié)構(gòu)域 而生成。
[0021] 本發(fā)明的第二方面是提供運(yùn)樣的抗體，其中已通過將一個(gè)疏水性氨基酸突變成帶 正電的氨基酸并將另一個(gè)突變成帶負(fù)電的氨基酸而將靜電相互作用引入了疏水性相互作 用區(qū)。W上正電荷可W是堿性的但不限于此，并且W上負(fù)電荷可W是酸性的但不限于此。
[0022] 具體地，抗體因W下兩者之間的靜電相互作用而具有結(jié)合力：任一個(gè)氨基酸突變 成選自天冬氨酸或谷氨酸的酸性氨基酸，而另一個(gè)突變成選自賴氨酸、精氨酸或組氨酸的 堿性氨基酸，其中，突變被引入選自W下的一個(gè)或多個(gè)氨基酸對(duì)：CH3結(jié)構(gòu)域中的351亮氨 酸和351亮氨酸疏水性相互作用對(duì)、395脯氨酸和397鄉(xiāng)氨酸疏水性相互作用對(duì)、395脯氨 酸和395脯氨酸疏水性相互作用對(duì)、407酪氨酸和407酪氨酸疏水性相互作用對(duì)；W及人抗 體的CHl結(jié)構(gòu)域與化結(jié)構(gòu)域之間的128亮氨酸和118苯丙氨酸對(duì)、128亮氨酸和133鄉(xiāng)氨 酸對(duì)、141丙氨酸和116苯丙氨酸對(duì)、141丙氨酸和135亮氨酸對(duì)、145亮氨酸和133鄉(xiāng)氨酸 對(duì)、170苯丙氨酸和135亮氨酸對(duì)、185鄉(xiāng)氨酸和118苯丙氨酸對(duì)W及185鄉(xiāng)氨酸和135亮 氨酸對(duì)。更具體地，抗體被表征為在選自表4中的ZO至Z14的一組組合上發(fā)生突變?？?體可帶有一對(duì)具有一對(duì)功能的胞外域。胞外域可在癌癥和信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮作用，并且該毒 素可用于治療通過另一種特異性抗體結(jié)合的與細(xì)胞死亡相關(guān)的癌癥。胞外域可W是選自 TNR2、Her3、Tie2、TGFbRU BMPbRU Il-12R-bl、IL-4Ra、ITGA4、ITGA2B、INFAR1、IL-12A、 IL-4、InFa、BMP2、IL-lRlL、IL-17RA、n^-17AJas、FltD2、Herl、Tiel、TGFbR2、n^-12R-b2、 比-13Ral、IT