片狀細胞培養(yǎng)物的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及高活性的片狀細胞培養(yǎng)物的制造方法、用該制造方法制造的片狀細胞培養(yǎng)物、包含該片狀細胞培養(yǎng)物的醫(yī)藥組合物、使用該片狀細胞培養(yǎng)物的疾病處理方法等。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，為了修復(fù)損傷的組織等，進行了移植各種細胞的嘗試。例如，為了修復(fù)因心絞痛、心肌梗塞等缺血性心臟病而導(dǎo)致?lián)p傷的心肌組織，嘗試利用了胎兒心肌細胞、骨骼肌成肌細胞、間充質(zhì)干細胞、心臟干細胞、ES細胞等(非專利文獻I)。
[0003]作為上述嘗試的一環(huán)，開發(fā)出了利用支架(scaffold)形成的細胞結(jié)構(gòu)物、使細胞形成為片狀而得的片狀細胞培養(yǎng)物(專利文獻I)。
[0004]關(guān)于片狀細胞培養(yǎng)物在治療中的應(yīng)用，已開展了下述研究:針對由燒傷等導(dǎo)致的皮膚損傷的培養(yǎng)表皮片的利用、針對角膜損傷的角膜上皮片狀細胞培養(yǎng)物的利用、針對食道癌內(nèi)窺鏡切除的口腔黏膜片狀細胞培養(yǎng)物的利用等。
[0005]為了使片狀細胞培養(yǎng)物植入所移植的組織中并發(fā)揮所期望的功能，需要向該培養(yǎng)物供給氧、營養(yǎng)等，就此而言，已知具有血管新生作用的HGF(肝細胞生長因子，Hepatocytegrowth factor)、VEGF(血管內(nèi)皮生長因子，Vascular endothelial growth factor)等各種細胞因子的作用是有用的(專利文獻I)。因此，可以認為如果能使基于片狀細胞培養(yǎng)物的這些細胞因子的產(chǎn)生能力提高，就可以提高片狀細胞培養(yǎng)物的植入率、功能性。另外，已知這些細胞因子對組織的再生有用(非專利文獻2)，因此，也可以認為由片狀細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的細胞因子對移植靶標(biāo)的組織發(fā)揮作用，從而促進該組織的再生。但是，成本低且簡單的提高片狀細胞培養(yǎng)物的細胞因子產(chǎn)生能力的方法尚未為人所知。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:日本特表2007-528755號公報
[0009]非專利文獻
[0010]非專利文獻1:Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med.2012 Feb ；1(2):136-41
[0011]非專利文獻2:Nakagami et al., J Atheroscler Thromb.2006 Apr ; 13 (2): 77-81

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于提供細胞因子產(chǎn)生能力等活性高的片狀細胞培養(yǎng)物、其制造方法、包含該片狀細胞培養(yǎng)物的醫(yī)藥組合物、及使用該片狀細胞培養(yǎng)物的疾病處理方法。
[0013]本申請的發(fā)明人在為解決上述課題而進行銳意研究的過程中，發(fā)現(xiàn)通過在制造片狀細胞培養(yǎng)物時設(shè)置將細胞冷凍.解凍的步驟，可以提高片狀細胞培養(yǎng)物的細胞因子產(chǎn)生能力等活性，從而完成了本發(fā)明。
[0014]S卩，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。
[0015](I)片狀細胞培養(yǎng)物的制造方法，所述方法包括:
[0016]將細胞冷凍的步驟；
[0017]將冷凍的細胞解凍的步驟；及
[0018]形成片狀細胞培養(yǎng)物的步驟。
[0019](2)如⑴所述的方法，其中，細胞為自體細胞或異體細胞。
[0020](3)如⑴或⑵所述的方法，其中，細胞為自體細胞。
[0021](4)如⑴?(3)中任一項所述的方法，其中，在將細胞解凍的步驟之后，在不使細胞實質(zhì)性增殖的情況下形成片狀細胞培養(yǎng)物。
[0022](5)如⑴?(4)中任一項所述的方法，其中，在形成片狀細胞培養(yǎng)物的步驟之后，還包括回收片狀細胞培養(yǎng)物的步驟，并且，將細胞解凍的步驟是在回收片狀細胞培養(yǎng)物的步驟前的48小時以內(nèi)進行的。
[0023](6)如⑴?(5)中任一項所述的方法，其中，在將細胞冷凍的步驟之前，包括使細胞增殖的步驟。
[0024](7)如⑴?(6)中任一項所述的方法，在將冷凍的細胞解凍的步驟之后、且在形成片狀細胞培養(yǎng)物的步驟之前，包括清洗細胞的步驟。
[0025](8)如⑴?(7)中任一項所述的方法，其中，細胞選自成肌細胞、間充質(zhì)干細胞、心肌細胞、成纖維細胞、心臟干細胞、胚胎干細胞、iPS細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞、胰細胞、腎細胞、腎上腺細胞、牙周韌帶細胞、牙齦細胞、骨膜細胞及皮膚細胞組成的組。
[0026](9)如⑴?⑶中任一項所述的方法，所述方法獲得活性比利用不包括將細胞冷凍的步驟和將冷凍的細胞解凍的步驟的方法制造的片狀細胞培養(yǎng)物高的片狀細胞培養(yǎng)物。
[0027](10)如(9)所述的方法，其中，活性選自細胞因子產(chǎn)生能力、植入能力、血管誘導(dǎo)能力及組織再生能力組成的組。
[0028](11)如(10)所述的方法，其中，細胞因子選自HGF及VEGF組成的組。
[0029](12)片狀細胞培養(yǎng)物，其是利用⑴?(11)中任一項所述的方法制造的。
[0030](13)醫(yī)藥組合物，其包含(12)所述的片狀細胞培養(yǎng)物。
[0031](14)對與對象中組織的異常相關(guān)的疾病進行處理的方法，所述方法包括將有效量的(12)所述的片狀細胞培養(yǎng)物或(13)所述的醫(yī)藥組合物施予至需要處理的對象。
[0032](15)如(14)所述的方法，其中，組織選自心肌、角膜、視網(wǎng)膜、食道、皮膚、關(guān)節(jié)、軟骨、肝臟、胰、牙齦、腎臟、甲狀腺、骨骼肌及中耳組成的組。
[0033](16)如(14)所述的方法，其中，疾病選自心臟疾病、角膜疾病、視網(wǎng)膜疾病、食道疾病、皮膚疾病、關(guān)節(jié)疾病、軟骨疾病、肝疾病、胰疾病、牙科疾病、腎臟疾病、甲狀腺疾病、肌肉疾病及中耳疾病組成的組。
[0034]利用本發(fā)明的方法制造的片狀細胞培養(yǎng)物，由于細胞因子產(chǎn)生能力等活性高，向組織中的植入及植入后的存活性、功能性、功能的持續(xù)性等優(yōu)異，因此，可以實現(xiàn)對各種疾病的有效處理。另外，通過利用本發(fā)明的方法制造的片狀細胞培養(yǎng)物所產(chǎn)生的細胞因子對移植靶標(biāo)的組織發(fā)揮作用，還可以促進該組織的再生。另外，本發(fā)明中的冷凍?解凍操作與以往的片狀細胞培養(yǎng)物制造方法的相容性高，所需的勞力和時間、成本極少，因此，本發(fā)明的制造方法可以廣泛用于片狀細胞培養(yǎng)物的制造。
【附圖說明】
[0035]圖1是表示片化培養(yǎng)步驟中被分泌至培養(yǎng)液中的VEGF及HGF的濃度的圖。
[0036]圖2是表示制造后的片狀細胞培養(yǎng)物分泌至培養(yǎng)液中的VEGF的濃度的圖。
[0037]圖3是表示制造后的片狀細胞培養(yǎng)物分泌至培養(yǎng)液中的HGF的濃度的圖。
[0038]圖4是表示利用例9的制造方法制作的片狀間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)物的照片圖像。在中央的4個連續(xù)的孔內(nèi)可觀察到片狀細胞培養(yǎng)物。
【具體實施方式】
[0039]本說明書中，只要未另行定義，則本說明書中使用的所有技術(shù)用語及科學(xué)用語均具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意思相同的含義。本說明書中提到的所有專利、申請、已公開的申請及其他出版物均通過引用全部并入本說明書中。
[0040]本發(fā)明一方面涉及一種片狀細胞培養(yǎng)物的制造方法，所述制造方法包括下述步驟:將細胞冷凍的步驟、將冷凍的細胞解凍的步驟、及形成片狀細胞培養(yǎng)物的步驟。雖不希望受到特定理論的限制，但可以認為在本發(fā)明的制造方法中，通過對細胞實施冷凍及解凍的步驟，活性弱的細胞脫落，而另一方面，活性強的細胞留存，作為片狀細胞培養(yǎng)物整體的活性升尚。
[0041]本發(fā)明的制造方法中的細胞，只要是能夠形成片狀細胞培養(yǎng)物的細胞則沒有特別限制，例如，包括貼壁細胞(粘附性細胞)。貼壁細胞包含例如具有貼壁性的體細胞(例如，心肌細胞、成纖維細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞、胰細胞、腎細胞、腎上腺細胞、牙周韌帶細胞、牙齦細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞等)、組織干細胞(例如，成肌細胞、心臟干細胞等)、多能干細胞(例如，胚胎干細胞、iPS細胞(induced pluripotentstem cell，誘導(dǎo)性多能干細胞)等)、間充質(zhì)干細胞等。因此，本發(fā)明的制造方法中的細胞包括例如成肌細胞(例如，骨骼肌成肌細胞等)、間充質(zhì)干細胞(例如，源于骨髓、脂肪組織、外周血、皮膚、毛根、肌肉組織、子宮內(nèi)膜、胎盤、臍帶血的細胞等)、心肌細胞、成纖維細胞、心臟干細胞、胚胎干細胞、iPS細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞(例如，口腔黏膜上皮細胞、視網(wǎng)膜色素上皮細胞、鼻黏膜上皮細胞等)、內(nèi)皮細胞(例如，血管內(nèi)皮細胞等)、肝細胞(例如，肝實質(zhì)細胞等)、胰細胞(例如，胰島細胞等)、腎細胞、腎上腺細胞、牙周韌帶細胞、牙齦細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等。
[0042]本發(fā)明中，“片狀細胞培養(yǎng)物”是指細胞相互連接呈片狀的培養(yǎng)物，典型的是由I個細胞層形成的細胞培養(yǎng)物，但也包括由2個以上的細胞層構(gòu)成的細胞培養(yǎng)物。細胞彼此可以直接(包括經(jīng)由粘附分子等細胞要素的方式)相互連接、及/或經(jīng)由中間物而相互連接。作為中間物，只要是至少能夠?qū)⒓毎舜宋锢硇?機械性)地連接的物質(zhì)，則不受特別限制，例如，可以舉出胞外基質(zhì)等。中間物優(yōu)選為來自細胞的物質(zhì)，特別優(yōu)選為來自構(gòu)成細胞培養(yǎng)物的細胞的物質(zhì)。細胞至少被物理性(機械性)地連接，也可以進一步被功能性地連接，例如化學(xué)性連接、電連接。
[0043]本發(fā)明的片狀細胞培養(yǎng)物優(yōu)選不包含支架(支撐體)。在本技術(shù)領(lǐng)域中，支架有時被用于使細胞附著在其表面上及/或其內(nèi)部從而維持細胞培養(yǎng)物的物理一體性，例如，已知有聚偏氟乙烯(PVDF)制的膜等，但本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物即使在沒有該支架時也能夠維持其物理一體性。另外，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物優(yōu)選僅包含來自構(gòu)成細胞培養(yǎng)物的細胞的物質(zhì)，不包含其它物質(zhì)。
[0044]本發(fā)明中的細胞可以來自能夠利用片狀細胞培養(yǎng)物進行治療的任意生物。所述生物不受限制，例如，包括人、非人靈長類、狗、貓、豬、馬、山羊、綿羊、嚙齒目動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等)、兔等。另外，用于形成片狀細胞培養(yǎng)物的細胞可以僅為I種，也可以使用2種以上的細胞。本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在形成細胞培養(yǎng)物的細胞有2種以上的情況下，最多的細胞的比率(純度)在細胞培養(yǎng)物制造結(jié)束時為60%以上，優(yōu)選為70%以上，更優(yōu)選為75%以上。
[0045]細胞可以是源自異種的細胞，也可以是源自同種的細胞。此處，關(guān)于“源自異種的細胞”，在細胞培養(yǎng)物被用于移植的情況下，表示源自與其受體為不同的種的生物的細胞。例如，受體為人時，源自猴、豬的細胞等屬于源自異種的細胞。另外，“源自同種的細胞”是指源自與受體為相同的種的生物的細胞。例如，受體為人時，人細胞屬于源自同種的細胞。源自同種的細胞包括自源細胞(也稱為自身細胞或自體細胞，即，源自受體的細胞)和同種非自