1 ; (4) 將洗脫物化.2. 1過ODS柱，ODS顆粒55g，并用體積濃度為80%甲醇洗脫，得到洗 脫物fr. 2. 1. 1 ; (5) 將上述洗脫物化.1，化.3,化.4,化.5,化.6,化.2. 1. 1，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50。C減壓 蒸干2~3小時，得到粗提物； (7 )將粗提物W體積濃度為60~85%的色譜級甲醇為洗脫劑，經(jīng)制備型HPLC分離，分別 得到11種麻味物質(zhì)單體提取物；制備型HPLC分離條件： 色譜柱：〇DS-425化（010X250mm, 5化），流速為1.5血/min;柱溫25°C;紫外檢測 波長270nm;進樣量：200化，甲醇-水溶液梯度洗脫，30min;手動收集最大吸收峰的洗脫 液； (8) 另外再單獨取步驟（1)中所得乙醇回流萃取液50g離屯、，300化pm，5min，得到上清 液，經(jīng)交聯(lián)葡聚糖LH-20柱用甲醇純化后得到第12種麻味物質(zhì)單體提取物； (9) 將上述12種麻味物質(zhì)單體提取物分別經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀55°C減壓蒸發(fā)1~2小時， 移除溶劑及其他雜質(zhì)，分別得到12種麻味物質(zhì)單體； (10) 將步驟（9)得到的12種麻味物質(zhì)的單體懸浮于水中1~2小時，經(jīng)高真空-0.IMPa 移除揮發(fā)物，冷凍干燥2次后分別得到12種粉末狀麻味物質(zhì)單體，真空分別包裝后避光保 存；冷凍干燥參數(shù)：預冷溫度-46°C，時間5小時；凍干溫度-40°C，5小時；-20°C，1小時， 0°C，1 小時；25°C，1 小時。
[0022] 本實施例中所用的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器廠的型號RE52-99的旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀。
[0023] 制備型HPLC分離條件： 色譜柱：0DS-425化（010X250mm, 5化），流速為1.5血/min;柱溫25°C;紫外檢測 波長270nm;進樣量：200化。甲醇-水溶液梯度洗脫，30min;手動收集最大吸收峰的洗 脫液即麻味物質(zhì)單體提取物。
[0024] 對本實施例所得麻味物質(zhì)作了如下測試方法： 1、麻味物質(zhì)分析鑒定方法 1. 1冊LC法 樣品處理：用色譜級甲醇溶解實施例所得麻味物質(zhì)，并稀釋至1111邑/111以用0. 45mm有 機相濾膜過濾，即可上樣。
[00幼色譜條件 色譜柱：麗Nucleodur1100 - 5C18 柱（04X125mm, 5ym);流動相：A水；B乙 臘；流速：0. 5血/min;柱溫：25°C;紫外檢測波長：270nm進樣量：20化。
[0026] 洗脫程序如表1所示。
[0027] 表1HPLC洗脫程序
1. 2LC-MS檢測 液相色譜條件： 色譜柱：麗Nucleodur1100 - 5C18 柱（04X125mm, 5ym);流動相：A水；B乙 臘；流速：〇. 5血/min;柱溫：25°C;進樣量：20化。
[002引質(zhì)譜條件： 電噴霧離子源（ESI):正離子電離；噴霧電壓：4500V;干燥氣流速：10L/min;干燥溫 度：35(rC;霧化氣壓力：2.07X102kPa;毛細管出口電壓：112.8V;刮削器電壓40V;掃 描范圍：m/z150~400。
[0029] 2、麻味物質(zhì)定量檢測方法 將實施例制備得到的麻味物質(zhì)樣品配制成不同濃度的溶液，W各濃度樣液在270nm下 吸收峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
[0030] 測試結(jié)果見表1: 表1測試結(jié)果表
從表I可見，與已經(jīng)發(fā)表的論文和已經(jīng)公開的專利相比，本發(fā)明提供的從藤椒中提取 麻味物質(zhì)的方法能夠分離出麻味單體，并且單體的種類多，含量高，純度高，單體純度達98% W上。
【主權(quán)項】
1. 一種從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： (1) 對藤椒進行乙醇回流萃取或進行CO2超臨界萃取，得萃取液； (2) 對萃取液進行柱層析，然后進行洗脫，得洗脫物； (3) 對洗脫物用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)，得到粗提物； (4) 對粗提物以甲醇為洗脫劑，經(jīng)制備型HPLC分離，分別得到11種麻味物質(zhì)單體提取 物； (5) 另取步驟（1)中所得乙醇回流萃取液離心分離得上清液，然后經(jīng)交聯(lián)葡聚糖LH-20 柱用甲醇純化后得到第12種麻味物質(zhì)單體提取物； (6) 將上述12種麻味物質(zhì)單體提取物分別經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)，移除溶劑及其他 雜質(zhì)，分別得到12種麻味物質(zhì)單體；然后將這12種麻味物質(zhì)單體懸浮于水中，經(jīng)真空移除 揮發(fā)物，冷凍干燥后分別得到12種粉末狀麻味物質(zhì)單體，真空分別包裝后避光保存。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法，其特征在于，所述乙醇回流 萃取方法為： (1) 將干燥后的藤椒葉去掉葉柄，果實去籽，采用小型電動粉碎機粉碎，過40目篩網(wǎng)， 得干藤椒粉密封避光冷藏備用； (2) 取干藤椒粉用體積濃度95%的乙醇按料液比1:5-10回流萃取1~3個小時，得到萃 取液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法，其特征在于，所述CO2超臨界 萃取方法為： (1) 將干藤椒或鮮藤椒進行CO2超臨界萃取，得到初級萃取液； (2) 將初級萃取液在2500rpm條件下離心5min得到上清液即為萃取液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法，其特征在于，所述步驟（2)的 柱層析方法為： 取萃取液進行硅膠柱層析，用6個梯度的氯仿-甲醇混合液進行洗脫，依次得到6個洗 脫物，命名為 fr. 1，fr. 2, fr. 3, fr. 4, fr. 5, fr. 6 ; 將洗脫物fr. 2再次進行硅膠柱層析，用苯-正己烷-丙酮為洗脫劑洗脫，得到洗脫物 fr. 2. 1 ； 將洗脫物fr. 2. 1過ODS柱并用甲醇洗脫，得到洗脫物fr. 2. 1. 1。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法，其特征在于：所述6個梯度 的氯仿-甲醇混合液中的氯仿、甲醇體積比分別為：10:1 ;5:1 ;10:3 ;5:2 ;2:1 ;5:3。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法，其特征在于：所苯-正己 烷-丙酮為洗脫劑中苯、正己烷、丙酮的體積比為5:2:1或5:3:2或6:3:1。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法，其特征在于：所述步驟（3)為 50° C條件下減壓蒸發(fā)2~3小時。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法，其特征在于：所述制備型 HPLC分離條件為： 色譜柱：〇DS-4251K (0 10X250 mm，5 Mm)，流速為 1.5 mL/min;柱溫 25°C;紫外檢測 波長270 nm;進樣量：200 ML;甲醇-水溶液梯度洗脫，30 min;手動收集最大吸收峰的洗脫 液。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法，其特征在于：所述步驟（4)中 11種麻味物質(zhì)單體為：羥基-a-山椒素、羥基-0 -山椒素、羥基-y-山椒素、羥基-y-異 山椒素、花椒素、異花椒素、a-山椒素、(6-山椒素、y-山椒素、羥基-e-山椒素、脫 氫-y-山椒素；步驟（5)中第12種麻味物質(zhì)單體為：多氫花椒素。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任意一項所述的從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法，其特征在于：該 方法包括以下步驟： (1) 原料預處理： 將干燥后的藤椒葉去掉葉柄，果實去籽，采用小型電動粉碎機粉碎，過40目篩網(wǎng)，得干 藤椒粉密封避光冷藏備用；取干藤椒粉用體積濃度95%的乙醇按料液質(zhì)量比1:5-10回流萃 取1~3個小時，得到萃取液； 或 a將干藤椒或鮮藤椒進行CO2超臨界萃取，得到初級萃取液； b將初級萃取液在2500rpm條件下離心5min得到上清液即為萃取液； (2) 取上述萃取液50 g進行硅膠柱層析，硅膠用量1000~1500g，分別用6個梯度的 氯仿-甲醇混合液進行洗脫，依次得到6個洗脫物，命名為f r. 1，fr. 2, fr. 3, fr. 4，fr. 5， fr. 6 ;所述6個梯度的氯仿-甲醇混合液中的氯仿、甲醇體積比分別為：10:1 ;5:1 ; 10:3 ; 5:2 ;2:1 ;5:3 ; (3) 將洗脫物fr. 2再次進行硅膠柱層析，硅膠用量250~375g，用苯-正己烷-丙酮為洗 脫劑，得到洗脫物fr. 2. 1 ;所苯-正己烷-丙酮洗脫劑中苯、正己烷、丙酮的體積比為5:2:1 或 5:3:2 或 6 :3:1 ; (4) 將洗脫物fr. 2. 1過ODS柱，ODS顆粒50~60g，并用體積濃度為80%甲醇洗脫，得到 洗脫物fr. 2. L 1 ; (5) 將上述洗脫物fr. 1，fr. 3, fr. 4, fr. 5, fr. 6, fr. 2. 1. 1，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50° C減壓 蒸干2~3小時，得到粗提物； (7 )將粗提物以體積濃度為60~85%的色譜級甲醇為洗脫劑，經(jīng)制備型HPLC分離，分別 得到11種麻味物質(zhì)單體提取物；制備型HPLC分離條件： 色譜柱：〇DS-4251K (0 10X250 mm，5 Mm)，流速為 1.5 mL/min;柱溫 25°C;紫外檢測 波長270 nm;進樣量：200 ML，甲醇-水溶液梯度洗脫，30 min;手動收集最大吸收峰的洗脫 液； (8) 另外再單獨取步驟（1)中所得乙醇回流萃取液離心，3000rpm，5min，得到上清液，經(jīng) 交聯(lián)葡聚糖LH-20柱用甲醇純化后得到第12種麻味物質(zhì)單體提取物； (9) 將上述12種麻味物質(zhì)單體提取物分別經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀55° C減壓蒸發(fā)1~2小時， 移除溶劑及其他雜質(zhì)，分別得到12種麻味物質(zhì)單體； (10) 將步驟（9)得到的12種麻味物質(zhì)的單體懸浮于水中1~2小時，經(jīng)高真空-0.1 MPa 移除揮發(fā)物，冷凍干燥2次后分別得到12種粉末狀麻味物質(zhì)單體，真空分別包裝后避光保 存；冷凍干燥參數(shù)：預冷溫度-46°C，時間5小時；凍干溫度-40°C，5小時；-20°C，1小時， 0°C，1 小時；25°C，1 小時。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從藤椒中提取麻味物質(zhì)的方法。所述方法為：將藤椒處理后得到藤椒粉，經(jīng)95%乙醇回流萃取后得到萃取液，首先進行硅膠柱層析，然后進行ODS柱層析，最后用交聯(lián)葡聚糖LH-20純化；將經(jīng)過制備型HPLC分離得到的麻味物質(zhì)單體懸浮于水中1-2小時，經(jīng)高真空移除揮發(fā)物，冷凍干燥2次后得到粉末狀麻味物質(zhì)單體。真空包裝后避光保存。本方法采用先進的分離純化技術(shù)得到了種類多、純度高的麻味物質(zhì)單體，能夠滿足多種需求。
【IPC分類】C07C233/09, C07C231/24, C07C233/20, A23L27/10
【公開號】CN105237430
【申請?zhí)枴緾N201510706734
【發(fā)明人】向奇, 趙志峰, 劉福權(quán), 謝王俊, 呂晶
【申請人】峨眉山萬佛綠色食品有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年10月27日