一株高產阿魏酸酯酶的枝狀枝孢菌及在食醋釀造中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株高產阿魏酸酯酶的枝狀枝孢菌及在食醋釀造中的應用，屬于發(fā)酵 工程與生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 阿魏酸酯酶（FEA，EC3. 1. 1. 73)是羧酸酯水解酶的一個亞類，主要生物功能是水 解植物細胞壁多糖與阿魏酸（FA)連結的酯鍵，從而將阿魏酸及其它苯丙烯酸釋放出來。目 前，報道的產阿魏酸酯酶的菌株約有30株，其中主要包括黑曲霉、米曲霉、土曲霉、黃曲霉、 黃柄曲霉、泡盛曲霉、塔賓曲霉、構巢曲霉、宇佐美曲霉、根霉、青霉、嗜熱側孢霉、尖孢鐮刀 菌、層出鐮刀菌、粗糙脈孢菌、米黑根毛霉、柄籃狀菌、變綠紅菇、杏鮑菇、出芽短梗霉、厭氧 真菌、新美麗絲菌等，但是這些菌株產阿魏酸酯酶的活力普遍較低，不足以滿足工業(yè)應用。 也有通過基因改造手段來提高微生物產阿魏酸酯酶能力的相關研究，但是目前構建的工程 菌株產量都不是很高，仍達不到工業(yè)化生產要求。因此探索酶活高、安全的野生型阿魏酸酯 酶產生菌顯得很有必要，具有極大的研究和開發(fā)價值。
[0003] 阿魏酸因為具有多種生理活性功能近幾年來一直成為人們研究的熱點。目前已報 道，阿魏酸對過氧化氫、超氧自由基、羥自由基、過氧化亞硝基都有強烈的碎滅作用。阿魏酸 可通過對內皮素（Endothelin，ET)的作用，起到降低血壓的功效。阿魏酸對感冒病毒、呼吸 道合胞體病毒和艾滋病病毒都有顯著抑制作。阿魏酸能降低心肌缺血的耗氧量，在臨床上 已用于治療冠心病、心絞痛。近年來，有關阿魏酸及其衍生物抑制結腸癌、直腸癌和舌癌的 報道在不斷增加。而且發(fā)現(xiàn)阿魏酸在護肝、治療糖尿病方面有顯著效果。
[0004]目前，國外有關阿魏酸的功能性食品的報道在逐漸增多，本發(fā)明旨在利用微生物 資源將生物廢棄資源通過發(fā)酵工程技術轉化為可利用物質添加到食醋發(fā)酵體系中，制得一 種富含阿魏酸的功能性保健食醋，加大保健醋的開發(fā)。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是：針對目前微生物阿魏酸酯酶活性較低，無法實現(xiàn) 工業(yè)化應用的問題，提供一株新的高產阿魏酸酯酶的枝狀枝孢菌，其可利用小麥麩皮發(fā)酵 產生阿魏酸酯酶，首次添加到食醋發(fā)酵過程中，所制得富含阿魏酸的食醋具有抗氧化、降血 壓、抗血栓、降血脂、抗菌消炎、預防癌癥、護肝、治療糖尿病等功效。
[0006] 本發(fā)明的第一個目的是提供一株新的高產阿魏酸酯酶的枝狀枝孢菌，來源于浙江 塔牌紹興酒有限公司黃酒麥曲，經過篩選，分離純化得到的。該枝狀枝孢菌（Cladosporium cladosporioides)，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，簡稱CCTCC，保藏編號為CCTCC NO:M2015549，保藏日期2015年9月16號，保藏地址為中國武漢武漢大學。
[0007] 本發(fā)明所得枝狀枝孢菌的平板觀察特征如下：在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)72h，菌株 菌落厚，呈厚絨毛狀，與培養(yǎng)基結合緊密，不易挑起。顏色初為煙褐色至綠褐色，后期為黑褐 色至黑色。菌落背面黑色。
[0008]所述枝狀枝抱菌的rDNAITS1-5. 8S-ITS2序列與Cladosporiumcladosporioides strainFR5-SAR1 同一性達到 100%。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供所述枝孢霉在生產阿魏酸酯酶方面的應用。
[0010] 所述生產阿魏酸酯酶是以麥麩作為培養(yǎng)基的主要成分。
[0011] 所述應用是將枝狀枝孢菌種子液按照3~8%的接種量接種于麥麩液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 基中進行培養(yǎng)，麥麩加量〇. 5~6 % (其余為水），培養(yǎng)溫度32~35 °C，培養(yǎng)時間48~120h， 通氧量 0· 5 ~2vvm，轉速 100 ~150r/min，ρΗ4· 8 ~6. 5。
[0012] 所述麥麩液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中還可以含有NaCl0. 3g/L，（NH4) 2S041. 3g/L， MgS04 · 7Η200· 3g/L，Κ2ΗΡ040 · 3g/L。
[0013] 本發(fā)明的第三個目的是提供所述枝狀枝孢菌在食醋釀造方面的應用。
[0014] 所述應用是在麥麩液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中接種枝狀枝孢菌，進行液體發(fā)酵得發(fā)酵料 液；然后將發(fā)酵料液按照占原料糯米質量10~40%的量加入到食醋釀造落缸工段，同時在 醋酸發(fā)酵工段多次流加占原料大米質量3~12%的發(fā)酵料液。
[0015] 所述應用是在醋酸發(fā)酵的第72h、96h、120h各流加一次發(fā)酵料液。
[0016] 所述食醋釀造包括浸米、蒸飯、淋飯、落缸、糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、淋醋、殺菌 工段。
[0017] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0018] 1.本發(fā)明提供了一種新的枝狀枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides)，所述菌 株具有高產阿魏酸酯酶的能力，極大的補充了提取束縛型阿魏酸菌的資料庫；所述枝狀枝 孢菌已經從生物界中分離純化出來，并且易于培養(yǎng)保存，繁殖迅速，生長能力強；
[0019] 2.本發(fā)明枝狀枝孢菌發(fā)酵產阿魏酸酯酶的酶活可達到308U/L，可以作為從植物 中提取束縛型酚酸的新型野生菌；
[0020] 3.本發(fā)明創(chuàng)造性地將枝狀枝孢菌麥麩發(fā)酵料液首次應用到食醋生產中，綜合利用 了小麥加工過程中的副產物一麩皮，實現(xiàn)了開發(fā)高品質食醋和節(jié)能減排的雙重效益；枝孢 霉麥麩發(fā)酵料液的使用，在保證原有食醋風味口感的前提下，具有顯著提升阿魏酸含量的 效果。
[0021] 4.按本發(fā)明的生產方法得到的食醋，最終測定食醋中阿魏酸含量達到45~ 80ppm，色澤明亮，酒精度低，口感清爽獨特，并具有一定的保健功能。
[0022] 生物保藏信息
[0023] 枝狀枝孢菌，分類學命名為枝狀枝孢菌S2CladosporiumcladosporioidesS2,于 2015年9月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編 號為CCTCCΝ0:Μ2015549。
【附圖說明】
[0024]圖1:枝狀枝孢菌在初篩培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；
[0025] 圖2 :枝狀枝孢菌PDA分離純化后的菌落形態(tài)；
[0026] 圖3:HPLC測定枝狀枝孢菌發(fā)酵液的色譜圖。
【具體實施方式】
[0027] 培養(yǎng)基配方：
[0028] 初篩培養(yǎng)基：NaCl0· 3g，（NH4)2S041. 3g，MgS04 · 7H20 0· 3g，Κ2ΗΡ040· 3g，瓊脂粉 18g，15ml阿魏酸乙酯（溶于10%V/V二甲基甲酰胺），蒸餾水1000ml，pH自然，121°C滅菌 20min〇
[0029] 純化培養(yǎng)基：馬鈴薯瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA固體培養(yǎng)基），馬鈴薯200g，蔗糖20g， 瓊脂18g，蒸餾水1000ml，pH自然，121°C滅菌20min。
[0030] 種子培養(yǎng)基：液體PDA培養(yǎng)基，不加瓊脂，pH自然，121°C滅菌20min。
[0031] 復篩培養(yǎng)基：NaCl0· 3g，（NH4)2S041. 3g，MgS04 ·7Η20 0· 3g，K2HP040 . 3g，蒸餾水 1L， pH6. 5。在250mL三角瓶中稱取lOg麥麩，再加入lOOmL液體部分，于121°C滅菌20min，得 復篩培養(yǎng)基。將培養(yǎng)24h的種子液按體積比為4 %的接種量接種到100mL復篩培養(yǎng)基中，于 30°C，200r/min下培養(yǎng)一定時間。
[0032] 實施例1 :枝孢霉菌株的篩選
[0033] 枝狀枝孢菌的初篩，通過以阿魏酸乙酯為唯一碳源，產生透明圈現(xiàn)象篩選出具備 產阿魏酸酯酶能力的菌株。
[0034] 從浙江塔牌紹興酒有限公司采取食醋麥曲樣品，取麥曲10g，放置在含90ml無菌 蒸餾水與玻璃珠的250mL三角瓶中，封口，在振蕩儀上200r/min振搖30m