一種簡(jiǎn)單快速分離尾孢屬單孢子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)單快速分離尾孢屬單孢子的方法，屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]尾孢屬真菌是植物病原菌，可寄生在植物的莖、葉、花或果實(shí)上引起病害發(fā)生。玉米灰斑病(Cercospora zeina) (Meisel B, Korsman J, Kloppers F J, et al.Cercosporazeina is the causal agent of grey leaf spot disease of maize in southernAfrica [J].European journal of plant pathology, 2009，124 (4): 577-583.)、甜菜褐斑病(Cercospora beticola)(Holtschulte B, Asher M J C, Molard M R, et al.Cercosporabeticola-worldwide distribut1n and incidence[J].Cercospora beticola Sacc.b1logy, agronomic influence and control measures in sugar beet.，2000:5-16.)、辣椒褐斑病(Cercospora capsici) (Kawagoe H.1nfluence of temperature andrelative humidity on disease occurrence of sweet pepper caused by Cercosporacapsici in a plastic house[J].Annals of the Phytopathological Society ofJapan, 1998, 64(2): 137-138.)等都是尾孢屬真菌引起的，造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，系統(tǒng)地研究尾孢屬致病菌種類及發(fā)生規(guī)律，有效地降低病害發(fā)生幾率，對(duì)減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。尾孢屬真菌生長(zhǎng)速度緩慢，普通的病組織分離法常無(wú)法分離到目標(biāo)病原菌或易被雜菌污染。
[0003]目前，常用單孢分離法分離病原菌，單孢分離法是植物病害研究中常用的分離方法之一，該技術(shù)不僅涉及病原真菌的分離純化、孢子形態(tài)觀察方面，而且在研究群體遺傳變異、生理生化特性等領(lǐng)域也有應(yīng)用。單孢分離方法有很多，總結(jié)概括為兩種類型，即使用特殊裝置或手工操作分離。
[0004]其中，“單抱子分離器”是一種單抱分離裝置(Constantinescu 0.An instrumentand procedure for single-spore isolat1n[J].Transact1ns of the BritishMycological Society, 1988,91(4): 700-702.)，但該裝置安裝較為復(fù)雜，需要對(duì)顯微鏡設(shè)備改造，且國(guó)內(nèi)未見(jiàn)此裝置的廣泛使用。相比之下，手工操作分離較為普遍，但不同方法也存在一些不足，例如，切取器分離法(Ho W C，Ko W H.A simple method forobtaining single-spore isolates of fungi[J].Botanical Bulletin of AcademiaSinica, 1997，38.)，需要在顯微鏡下對(duì)單孢子處標(biāo)記，然后用切取器切割單孢瓊脂塊，常出現(xiàn)切割的范圍不準(zhǔn)確，無(wú)法切到單孢的情況；直接在顯微鏡下挑取涂有孢子的瓊脂平板，但培養(yǎng)皿不能固定，也不能隨意移動(dòng)，造成分離率降低(方中達(dá).植病研究方法[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社，1998.);玻璃針?lè)?Choi Y W，Hyde K D, Ho W H.Single spore isolat1n offung1.Fungal Diversity, 1999，3:29-38.)、眉針?lè)?劉長(zhǎng)華，王振華.玉米絲黑穗病田間接種濃度與發(fā)病率關(guān)系的研究[J].玉米科學(xué)，2008，16(1): 119-121.)，這些方法基本都是通過(guò)挑針挑取孢子，制作挑針的工具多為昆蟲針或玻璃挑針，昆蟲針較細(xì)，在顯微鏡下易確定孢子位置，但昆蟲針較軟，不易挑取粘有孢子的瓊脂塊，而玻璃挑針的硬度適中，但直徑較粗，在顯微鏡視下觀察常常占滿整個(gè)視野，不能確定孢子的位置，同時(shí)，玻璃挑針的尖端易碎，在操作時(shí)要格外小心。這些因素降低了單孢分離的成功率和操作效率，在一定程度上限制了單孢分離法的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明在病原菌孢子分離過(guò)程中，綜合已有的單孢分離方法，利用病原分離中簡(jiǎn)單的設(shè)備，組成一種簡(jiǎn)易單孢分離器，并結(jié)合一種新的單孢分離方法，其具有操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、分離速度快、準(zhǔn)確性高、不宜污染等優(yōu)點(diǎn)。
[0006]術(shù)語(yǔ)解釋:
[0007]WA瓊脂液:是指用水和瓊脂配制而成的培養(yǎng)液，也稱為WA培養(yǎng)基(Water-agarmedium)-水-瓊脂培養(yǎng)基。
[0008]PDA平板培養(yǎng)基:是人們對(duì)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的簡(jiǎn)稱，即Potato DextroseAgar(Medium)。
[0009]本發(fā)明是通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的:
[0010]一種簡(jiǎn)單快速分離尾孢屬單孢子的方法，包括以下步驟，
[0011]a.選取具有發(fā)病癥狀的葉片，0-4°C保存，備分離用；
[0012]b.將取孢器高溫滅菌消毒，備用；所述取孢器的一端為取孢球、另一端為取孢鏟，所述取孢球?yàn)楸馄綀A狀，所述取孢鏟為扁平鏟子狀、端部呈尖狀；
[0013]c.配制濃度為0.030-0.035g/ml的WA瓊脂液，滅菌，在WA瓊脂液未凝固前，吸取WA瓊脂液，均勻涂布在載玻片上，使WA瓊脂液形成直徑10-15mm，厚度1-1.5mm的圓形瓊脂塊，制得瓊脂片，然后將瓊脂片放置在超凈無(wú)菌工作臺(tái)上凝固備用；
[0014]d.取經(jīng)過(guò)步驟a處理后的葉片，用無(wú)菌水沖洗、干燥；然后用步驟b制得的取孢球在葉片病斑處來(lái)回劃動(dòng)，使孢子粘附到取孢球上，再將粘附有孢子的取孢球在步驟c制得的瓊脂片上均勻涂布，最后將涂布的瓊脂片放在1X 10倍顯微鏡下，視野中觀察到I個(gè)孢子即可；
[0015]e.將經(jīng)過(guò)步驟d處理后的涂有孢子的瓊脂片放在25-28°C的環(huán)境下保濕培養(yǎng)22-24h ；
[0016]f.將顯微鏡放在超凈無(wú)菌工作臺(tái)上，把經(jīng)過(guò)步驟e培養(yǎng)后的瓊脂片放在載物臺(tái)上，在1X 10視野下找到剛萌發(fā)，尚未分支的目標(biāo)孢子，用取孢鏟將孢子周圍的瓊脂塊與瓊脂片其它部分的瓊脂分離，然后用取孢鏟尖狀端挑取帶有孢子的瓊脂塊，移入PDA平板培養(yǎng)基，放在25 °C恒溫環(huán)境下培養(yǎng)，獲得單孢菌株。
[0017]優(yōu)選的，步驟a中，將葉片裝入潔凈的自封袋內(nèi)，然后將自封袋放在裝有冰袋的塑料泡沫盒中，0-4°C保存帶到實(shí)驗(yàn)室，備分離用；
[0018]優(yōu)選的，步驟b中，將取孢器放入三角燒瓶中，封口，在120-125°C、103_104Kpa條件下，滅囷20min后，備用。
[0019]優(yōu)選的，步驟c中，將10ml純凈水裝入200ml三角燒瓶中，放入3_3.5g瓊脂制得濃度為0.030-0.035g/ml的WA瓊脂液。
[0020]優(yōu)選的，步驟d中，取經(jīng)過(guò)步驟a處理后的葉片，用75 %酒精表面消毒，無(wú)菌水沖洗3次，然后用滅菌濾紙擦干葉片表面。
[0021]優(yōu)選的，步驟d中，取孢球在葉片病斑處來(lái)回劃動(dòng)之前，先在含有2%乳酸的滅菌水中蘸取。此設(shè)計(jì)的好處在于，取孢球在蘸取了含2%乳酸的滅菌水后，其具有一定的黏著性，便于粘附孢子。
[0022]優(yōu)選的，步驟e中，將涂有孢子的瓊脂片放置在鋪有濕潤(rùn)吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)，25 °C下培養(yǎng)24h。此設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)在于，瓊脂片較薄，含水量低，容易干燥，放置在鋪有濕潤(rùn)吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，利于保濕培養(yǎng)。
[0023]優(yōu)選的，步驟f中，將顯微鏡放在超凈無(wú)菌工作臺(tái)上后，用無(wú)菌脫脂棉蘸75%酒精擦拭顯微鏡的鏡頭和載物臺(tái)，紫外燈照射30min。
[0024]本發(fā)明的有益效果在于:
[0025]1.本發(fā)明單孢分離方法采用特制的取孢器挑取孢子，特制的取孢器能少量粘附病原孢子，并能均勻涂布于培養(yǎng)基上，保證10X10倍的視野中有I個(gè)孢子出現(xiàn)，孢子密度低，容易找到目標(biāo)孢子，且不容易粘附葉片殘?bào)w，易于分離病原孢子，有效提高了分離率和分離速度。
[0026]2.本方法采用特制的取孢器挑取的孢子為培養(yǎng)24小時(shí)已萌發(fā)的孢子，有效地避免了采用其他方法挑取單孢后不能萌發(fā)的結(jié)果，成功率高。
[0027]3.本方法采用特制的取孢器，使用取孢器一端的取孢球通過(guò)粘附取孢的方式進(jìn)行挑取孢