骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法及其誘導(dǎo)液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法以及 所使用的誘導(dǎo)液。
【背景技術(shù)】
[0002] 冠心病心肌梗死及心力衰竭是嚴(yán)重影響人民生活質(zhì)量和壽命的主要疾病之一。研 究資料顯示，成熟的心肌細(xì)胞缺乏再生能力，心肌梗死（MI)發(fā)生后，梗死區(qū)心肌只能通過(guò) 纖維組織增生，由無(wú)收縮功能的疤痕組織代替，導(dǎo)致心功能下降。臨床上缺乏針對(duì)梗死心肌 再生、重建的根本性治療方法，而細(xì)胞替代治療應(yīng)運(yùn)而生成為一個(gè)理想的治療策略。
[0003] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一種類似成 纖維細(xì)胞的一類細(xì)胞，具有多方向分化潛能，可以向骨組織、軟骨組織、皮膚、造血干細(xì)胞支 持介質(zhì)、骨骼肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還具有取材方便、無(wú)免疫原 性、具有多向分化潛能、合乎倫理學(xué)要求并且無(wú)致瘤性，具有其它干細(xì)胞不可比擬的優(yōu)勢(shì)， 因此，探討MSCs體外大量擴(kuò)增及向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化條件將對(duì)損傷心肌的修復(fù)治療具有 深遠(yuǎn)意義。
[0004] 在研究MSCs向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)中，目前主要使用化學(xué)誘導(dǎo)劑5-氮胞苷 (5-azacytidine，5-AZA)。5-AZA是胞苷的類似物，它可以與DNA共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物從而 導(dǎo)致DNA甲基在細(xì)胞分裂周期中進(jìn)行性丟失，發(fā)揮去甲基化作用，啟動(dòng)MyoD等某些相關(guān)等 位基因的表達(dá)。國(guó)外有學(xué)者將成年小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后，能產(chǎn)生自主收縮 的肌管結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)，顯微鏡下結(jié)構(gòu)類似胚胎心肌細(xì)胞。但細(xì)胞經(jīng)過(guò)5-AZA處理后可導(dǎo)致 細(xì)胞部分皺縮，脫壁，降解、或胞漿內(nèi)形成脂肪空泡，說(shuō)明5-AZA作為一種誘導(dǎo)劑對(duì)細(xì)胞也 有一定毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為心 肌細(xì)胞的方法所獲得的心肌細(xì)胞存在細(xì)胞易皺縮脫壁死亡等缺陷，提供一種能夠提高骨髓 間充質(zhì)干細(xì)胞的活性及轉(zhuǎn)化率的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法及該方法中所使用的誘導(dǎo) 液。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：提供一種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo) 方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0007] 獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)；
[0008] 在體外培養(yǎng)過(guò)程中用誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)；
[0009] 其中，所述誘導(dǎo)液包括血管緊張素II和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。
[0010] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法中，所述血管緊張素II的濃度為 1-5μmol/L，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的濃度為50-200μg/L。
[0011] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法中，獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法 步驟包括：
[0012] 抽取人骨髓，在含有低糖DMEM的離心管中混合，再過(guò)篩，得到細(xì)胞懸液，再將所述 細(xì)胞懸液加入到含Percoll分層液的離心管中，離心，獲取單個(gè)核細(xì)胞。
[0013] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法中，所述Percoll分層液的密度為 1.067-1. 082kg/L〇
[0014] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法中，獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法 步驟還包括：在獲取單個(gè)核細(xì)胞后，用含有胎牛血清、青霉素和/或鏈霉素的DMEM對(duì)單個(gè)核 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，再于〇)2培養(yǎng)箱中孵育，36-96個(gè)小時(shí)后更換培養(yǎng)基，除去未貼壁的細(xì)胞，以 后每2-4天換液1次，直到單個(gè)核細(xì)胞增殖達(dá)到融合狀態(tài)，即獲得純化后的原代骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞。
[0015] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法中，所述DMEM培養(yǎng)基中，胎牛血清 的濃度為180_120mg/L，青霉素的濃度為90-110ug/ml，和/或鏈霉素的濃度為90-110ug/ ml〇
[0016] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法中，用所述誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)反應(yīng)之 前，還包括對(duì)原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)的過(guò)程，包括以下步驟：
[0017]S21、用1. 5~3mL/L胰蛋白酶將原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞消化分離，再用完全培養(yǎng) 基中止消化，制成細(xì)胞懸液；然后傳代接種于含新生牛血清的DMEM培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，隔1~3 天換液，直至細(xì)胞達(dá)到90 %以上融合；
[0018]S22、重復(fù)步驟S21繼續(xù)傳代至第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，用胰蛋白酶消化制成 細(xì)胞懸液，再用PBS沖洗后，以0. 5~1. 5X105個(gè)/ml的密度接種于多孔板上，培養(yǎng)2-5天。
[0019] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法中，用所述誘導(dǎo)液對(duì)第4代骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)反應(yīng)，包括以下步驟：
[0020] 利用所述誘導(dǎo)液誘導(dǎo)分化12-36個(gè)小時(shí)，吸棄誘導(dǎo)液，再用PBS清洗3次，繼續(xù)用 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2-5天換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)1-4周。
[0021] 在本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法中，所述DMEM培養(yǎng)基中，所述多孔 板中內(nèi)置涂有多聚賴氨酸的蓋玻片。
[0022] 本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法中所使用的誘導(dǎo)液，該誘導(dǎo)液包 括濃度為1-5μmol/L的血管緊張素II，和濃度為50-200μg/L的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。
[0023] 實(shí)施本發(fā)明提供的誘導(dǎo)液及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，可以達(dá)到以下有益效 果：通過(guò)采用能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的骨形態(tài)發(fā)生蛋白以及能夠促進(jìn)骨 髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的血管緊張素II作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，不僅能夠 防止骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞過(guò)早脫壁凋亡，而且能夠提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性，并提高其 轉(zhuǎn)化率。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中采用5-氮胞苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成的心肌細(xì)胞存在 細(xì)胞易皺縮脫壁、降解死亡等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于提供一種新的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 的誘導(dǎo)方法及誘導(dǎo)液，該方法中采用血管緊張素II和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2作為誘導(dǎo)劑進(jìn)行 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)，不僅能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成心肌細(xì)胞，提高轉(zhuǎn) 化率，而且還能夠增強(qiáng)細(xì)胞活性，解決了現(xiàn)有技術(shù)中，由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化后獲得的心 肌細(xì)胞易脫壁降解死亡的問(wèn)題。
[0025] 具體地，本發(fā)明提供的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，先獲取到骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞進(jìn)行體外培養(yǎng)；在體外培養(yǎng)過(guò)程中利用本發(fā)明的誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)反應(yīng)。在本發(fā)明實(shí)施 例中，體外培養(yǎng)過(guò)程包括先提純出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，傳代培 養(yǎng)，誘導(dǎo)反應(yīng)等步驟。具體包括以下步驟：
[0026] S1、獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0027]S2、對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)至第四代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0028]S3、用誘導(dǎo)液對(duì)第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)反應(yīng)至收獲心肌細(xì)胞。
[0029] 進(jìn)一步地，在步驟S1中，本發(fā)明所采用的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是通過(guò)密度梯度離心 結(jié)合貼壁培養(yǎng)的方式分離純化獲取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，密度梯度離心法能夠根據(jù)不同細(xì) 胞之間存在的沉降系數(shù)差，在一定離心介質(zhì)和離心力作用下，不同細(xì)胞各自以一定速度沉 降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶，從而能夠去除骨髓血中的大量紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和成纖 維細(xì)胞等混雜細(xì)胞。然后，再利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的特性對(duì)密度梯度離心法獲 得的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，通過(guò)去除非貼壁細(xì)胞，以進(jìn)一步純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。步 驟S1的具體過(guò)程為：
[0030]S11、密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞；
[0031] 抽取人骨髓，在含有低糖DMEM的離心管中混合，再過(guò)篩，得到細(xì)胞懸液，再將所述 細(xì)胞懸液加入到含Percoll分層液的離心管中，離心，獲取單個(gè)核細(xì)胞。其中，Percoll分 層液的密度為1. 067-1. 082kg/L。
[0032]S12、貼壁培養(yǎng)法進(jìn)一步純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0033] 用含有胎牛血清、青霉素和/或鏈霉素的DMEM對(duì)步驟S11獲得的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行 培養(yǎng)，再于〇)2培養(yǎng)箱中孵育，36-96個(gè)小時(shí)后更換培養(yǎng)基，除去未貼壁的細(xì)胞，以后每2-4 天換液1次，直到單個(gè)核細(xì)胞增殖達(dá)到融合狀態(tài)，即獲得純化后的原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0034] 其中，DMEM培養(yǎng)基中，胎牛血清的濃度為180-120mg/L，青霉素的濃度為 90-110ug/ml，和/或鏈霉素的濃度為90-110ug/ml。青霉素能夠阻礙細(xì)菌的細(xì)胞壁合成，導(dǎo) 致細(xì)胞泄漏死亡，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)；鏈霉素能夠作用于細(xì)菌的核糖體，阻礙蛋白翻譯， 從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；自然環(huán)境下，不考慮人為產(chǎn)生的抗藥性，對(duì)青霉素不敏感的絕大多數(shù)微 生物對(duì)鏈霉素敏感，反之亦然；因此，最為優(yōu)選地是將青霉素和鏈霉素搭配使用能夠控制幾 乎全部常見(jiàn)的細(xì)菌，從而能夠盡量避免細(xì)菌對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)及活性造成的不良 影響。
[0035] 步驟S2中，對(duì)原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以獲取生長(zhǎng)及活性最佳的第 四代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)反應(yīng)，具體步驟為：
[0036]S21、用1. 5~3mL/L胰蛋白酶將步驟S12中獲得的原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行消 化分離，再用完全培養(yǎng)基中止消化，制成細(xì)胞懸液；然后傳代接種于含新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，隔1~3天換液，直至細(xì)胞達(dá)到90%以上融合；
[0037]S22、重復(fù)步驟S1繼續(xù)傳代至第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，用胰蛋白酶消化制成細(xì) 胞懸液，再用PBS沖洗后，以0. 5~1. 5X105個(gè)/ml的密度接種于多孔板上，培養(yǎng)2-5天。
[0038] 其中，多孔板中內(nèi)置涂有多聚賴氨酸的蓋玻片；多聚賴氨酸是帶正電荷的氨基酸， 能夠消除器皿與細(xì)胞膜的電荷排斥作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞與器皿的粘合，提高細(xì)胞貼壁能力。 因此，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞置于涂有多聚賴氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì) 干細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。
[0039] 步驟S3的具體過(guò)程為：
[0040] 利用誘導(dǎo)液對(duì)步驟S22中獲得的第4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化12-36個(gè) 小時(shí)，吸棄誘導(dǎo)液，再用PBS清洗3次，繼續(xù)用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2-5天換液一次，繼續(xù)培 養(yǎng)1-4周至心肌細(xì)胞成熟并增殖到臨床使用量。
[0041 ] 其中，誘導(dǎo)液包括血管緊張素II和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2。血管緊張素II是一種膚類 激素，作為一種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子，能夠刺激血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的增殖；另外， 血管緊張素II是血管平滑肌細(xì)胞強(qiáng)大的絲裂原，它可通過(guò)自分泌、旁分泌刺激血管平滑肌 細(xì)胞的DNA和蛋白質(zhì)合成增加，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目增多；還可促進(jìn)血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF)、 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF)的合成和釋放，使血管緊張素II促血管平滑肌細(xì)胞分裂、 增殖作用加強(qiáng)；血管緊張素II與其受體結(jié)合，能活化多條信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞活化；優(yōu)選 地，血管緊張素II的濃度為1-5μmol/L。而骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一族多功能的糖蛋白，屬于 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族成員，可調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，分化和凋亡。優(yōu)選地，骨形態(tài) 發(fā)生蛋白的濃度為50-200μg/L。
[0042] 本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證明，血管緊張素II結(jié)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白共同誘導(dǎo)骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞，能夠抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)