人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充 質(zhì)干細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨髓間充質(zhì)干細胞（Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一種類似成 纖維細胞的一類細胞，具有多方向分化潛能，可以向骨組織、軟骨組織、皮膚、造血干細胞支 持介質(zhì)、骨骼肌細胞及心肌細胞轉(zhuǎn)化。自體骨髓間充質(zhì)干細胞還具有取材方便、無免疫原 性、具有多向分化潛能、合乎倫理學(xué)要求并且無致瘤性，具有其它干細胞不可比擬的優(yōu)勢， 因此，探討MSCs體外大量擴增具有深遠意義。
[0003]目前骨髓間充質(zhì)干細胞的體外擴增多采用二維培養(yǎng)方式進行的，也有部分采用三 維細胞培養(yǎng)支架進行培養(yǎng)，但均是采用單一的三維細胞培養(yǎng)支架，由于單一的三維細胞培 養(yǎng)支架存在機械性能弱，不穩(wěn)固等問題，因此，在培養(yǎng)過程中，容易從三維細胞培養(yǎng)支架的 三維培養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變成二維培養(yǎng)方式，從而使得骨髓間充質(zhì)干細胞活性差，擴增不明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)中采用單一的三維支架培養(yǎng)骨髓間 充質(zhì)干細胞的方法因支架機械性能弱，不穩(wěn)固，生物相容性差等造成骨髓間充質(zhì)干細胞擴 增率不高、細胞活性差等缺陷，提供一種能夠采用兩種及以上三維支架的人工模擬骨髓微 環(huán)境進行骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng) 骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，包括以下步驟：
[0006] 獲取骨髓間充質(zhì)干細胞，采用三維細胞培養(yǎng)支架于培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)；
[0007] 其中，所述三維細胞培養(yǎng)支架由骨基質(zhì)明膠、殼聚糖季銨鹽水凝膠和脫細胞軟骨 勻漿中的至少兩種材料制成。
[0008] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，獲取骨髓 間充質(zhì)干細胞的步驟包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分離液中離心，取中層單核細 胞，PBS緩沖液離心洗滌，棄上清液，即收獲原代骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0009] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，獲取骨髓 間充質(zhì)干細胞的步驟還包括對原代骨髓間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)的過程，包括以下步 驟：將原代骨髓間充質(zhì)干細胞濃度調(diào)整至1X1〇6~1X10 8個/25ml，加入所述培養(yǎng)基進行 培養(yǎng)；當(dāng)細胞生長到融合時，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，見胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，加入 含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，按1 :2~1 :3比例接種進行傳代培養(yǎng)至細胞生長到融 合，繼續(xù)傳代至獲得第三代骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0010] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，采用三維 培養(yǎng)支架進行體外培養(yǎng)的步驟為：取三維培養(yǎng)支架復(fù)溶，取第三代骨髓間充質(zhì)干細胞，PBS 清洗，胰酶-EDTA消化，以1X10s~1X101(]L1細胞濃度與復(fù)溶后三維培養(yǎng)支架共同接種于 所述培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0011] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，三維培養(yǎng) 支架復(fù)溶過程中，還添加有助溶劑。
[0012] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，所述助溶 劑為乙醇，且乙醇的質(zhì)量分數(shù)為5% -15%。
[0013] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，所述培養(yǎng) 基為血清培養(yǎng)基，且所述血清培養(yǎng)基中添加有10 6~10smol/L的氫化可的松、80-120U/ml 的青霉素及80-120mg/ml的鏈霉素。
[0014] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，所述殼聚 糖季銨鹽水凝膠的制備過程為：按1:2~1:5的質(zhì)量比將殼聚糖與2, 3-環(huán)氧丙基三甲基 氯化銨于70~95°C水浴中反應(yīng)7-10小時，加入無水乙醇，析出殼聚糖季銨鹽，將殼聚糖季 銨鹽再溶于乙醇中凝膠化，即獲得殼聚糖季銨鹽水凝膠。
[0015] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，所述三維 細胞培養(yǎng)支架由0. 2~lg的骨基質(zhì)明膠和0. 2~lg的殼聚糖季銨鹽水凝膠組合而成；
[0016] 或，所述三維細胞培養(yǎng)支架由0. 2~lg的骨基質(zhì)明膠和15_50g/L的脫細胞軟骨 勻漿組合而成；
[0017] 或，所述三維細胞培養(yǎng)支架由0. 2~lg的殼聚糖季銨鹽水凝膠和15_50g/L的脫 細胞軟骨勻衆(zhòng)組合而成。
[0018] 在本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法中，所述三維 細胞培養(yǎng)支架由〇. 2~lg的骨基質(zhì)明膠、0. 2~lg的殼聚糖季銨鹽水凝膠和15-50g/L的 脫細胞軟骨勻漿組合而成。
[0019] 實施本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，可以達到 以下有益效果：通過采用骨基質(zhì)明膠、殼聚糖季銨鹽水凝膠和脫細胞軟骨勻漿中的兩種或 兩種以上的組合作為三維培養(yǎng)支架，不僅能夠維持模擬骨髓微環(huán)境的三維多孔結(jié)構(gòu)，而且 能夠提高骨髓間充質(zhì)干細胞的吸附能力及生長增殖能力等，從而提高了骨髓間充質(zhì)干細胞 的增殖率及細胞活性，解決了現(xiàn)有技術(shù)中，采用單一三維培養(yǎng)支架培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞 存在支架生物相容性差，機械性能弱等缺陷造成細胞活性差、易死亡、增殖率低等問題。
【具體實施方式】
[0020] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中采用單一的三維細胞培養(yǎng)支架培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞存在細 胞活性差，增殖率低等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點在于提供一種采用兩種及以上的三維細胞培 養(yǎng)支架以人工模擬骨髓微環(huán)境進行培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，避免了單一的三維細胞 培養(yǎng)支架生物相容性差，機械性能弱，不穩(wěn)固等問題，從而可真正實現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞的 三維培養(yǎng)，不僅能夠提高骨髓間充質(zhì)干細胞的活性，而且還能夠提高骨髓間充質(zhì)干細胞的 擴增率。
[0021] 具體地，本發(fā)明提供的人工模擬骨髓微環(huán)境培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的方法，包括 以下步驟：
[0022] S1、獲取骨髓間充質(zhì)干細胞；
[0023] S2、采用三維細胞培養(yǎng)支架于培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)；其中，三維細胞培養(yǎng)支架是 由骨基質(zhì)明膠、殼聚糖季銨鹽水凝膠和脫細胞軟骨勻漿中的兩種或兩種以上材料組合制成 的。
[0024] 進一步地，步驟S1中還包括原代骨髓間充質(zhì)干細胞的獲取，及原代骨髓間充質(zhì)干 細胞的傳代培養(yǎng)，具體為：
[0025] S11、原代骨髓間充質(zhì)干細胞的獲?。?br>[0026] 采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分離液中離心，取中層單核細胞，加入PBS緩沖 液，離心洗滌，棄上清液，即收獲原代骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0027] S12、對原代骨髓間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)至第三代骨髓間充質(zhì)干細胞：
[0028] 將原代骨髓間充質(zhì)干細胞調(diào)整至1X106~1X108個/25ml，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)， 優(yōu)選地，該培養(yǎng)基為血清培養(yǎng)基，且血清培養(yǎng)基中添加有10 6~10smol/L的氫化可的松、 80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的鏈霉素。當(dāng)細胞生長到融合時，PBS漂洗2~3次， 加入胰蛋白酶，見胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，按 1 :2~1 :3比例傳代接種培養(yǎng)至細胞生長至IJ融合，重復(fù)上述操作繼續(xù)傳代，艮PPBS漂洗2~ 3次，加入胰蛋白酶，見胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消 化，按1 :2~1 :3比例傳代接種培養(yǎng)至細胞生長到融合，即獲得第三代骨髓間充質(zhì)干細胞。
[0029] 步驟S2