一種復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細(xì)胞，MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。
[0003]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于成體骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞，與臍帶、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，其具有較強(qiáng)的自我更新及多向分化潛能。間充質(zhì)干細(xì)胞在分離培養(yǎng)后需要通過低溫冷凍保存，在使用時(shí)再經(jīng)過復(fù)蘇進(jìn)行組織器官損傷修復(fù)。
[0004]文獻(xiàn)《凍存復(fù)蘇后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和多向分化潛能研究》(浙江大學(xué)學(xué)報(bào)工學(xué)版，第40卷第11期，2006年11月)記載了當(dāng)前復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的普遍方法:
[0005]在復(fù)溫時(shí)從液氮中取出樣品立即放入37°C水浴鍋內(nèi)搖動(dòng)凍存管，l-2min后復(fù)溫完畢，加入新鮮的培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為10 %的FBS的α -MEM培養(yǎng)液)400g離心5min，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)液放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80 % -90 %融合后，用消化液消化并以1:3傳代進(jìn)一步擴(kuò)增.
[0006]雖然上述復(fù)蘇的方法比較簡(jiǎn)單、快捷，但是該方法復(fù)蘇后的細(xì)胞活力偏低，不利于后續(xù)的進(jìn)行組織器官損傷修復(fù)等臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，使得所述方法能夠提高復(fù)蘇后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活力，并且仍然保持可以分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞的能力。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0009]—種復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括:
[0010]步驟1、將傳代至P3-P5代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞先用間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再用無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)收集培養(yǎng)基上清，將各時(shí)間段上清離心后再取上清混合，獲得條件培養(yǎng)基；
[0011]步驟2、將凍存的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞解凍，并加入到步驟1收集的條件培養(yǎng)基中離心去上清，然后再次加入條件培養(yǎng)基重懸并培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到要求。
[0012]針對(duì)現(xiàn)有方法復(fù)蘇凍存的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后細(xì)胞活力不高的問題，本發(fā)明在復(fù)蘇時(shí)不采用傳統(tǒng)方法中慣用的商業(yè)培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇，而是采用培養(yǎng)過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基來進(jìn)行復(fù)蘇，可顯著改善復(fù)蘇后細(xì)胞活力不高的現(xiàn)象。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)利用條件培養(yǎng)液可有效提高復(fù)蘇細(xì)胞或組織的活力，而且不同來源的條件培養(yǎng)液對(duì)不同細(xì)胞、組織的活力有不同的促進(jìn)或抑制作用。
[0013]其中，作為優(yōu)選，步驟1為:
[0014]將傳代至P3-P5代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞按照5000-10000/cm2的細(xì)胞密度用間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，用Hanks清洗后，再用無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、72h時(shí)收集培養(yǎng)基上清，1000-2000rpm離心5_10min，去除沉淀，收集所有上清混合，濾膜過濾后獲得條件培養(yǎng)基。
[0015]對(duì)于本發(fā)明所述條件培養(yǎng)基中的細(xì)胞接種密度、離心操作的參數(shù)、培養(yǎng)時(shí)間和環(huán)境等可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，本發(fā)明僅是給出比較優(yōu)選的參數(shù)，但并不僅限于這些參數(shù)及其組合，對(duì)于本發(fā)明其他方法步驟中出現(xiàn)的類似參數(shù)也不僅限于所提供的優(yōu)選參數(shù)及其組合。
[0016]作為優(yōu)選，所述間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0017]對(duì)于P3-P5代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可按照本領(lǐng)域常規(guī)的分離方法以及傳代方法來獲得，本發(fā)明提供了如下優(yōu)選的獲得方法:
[0018]從正常人骨髓樣本中分離出單核細(xì)胞層，離心清洗細(xì)胞沉淀，用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長培養(yǎng)基重懸沉淀并培養(yǎng)48h，然后更換骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80% -90%,獲得P0代；
[0019]用胰蛋白酶消化P0代貼壁細(xì)胞，離心后用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并傳代培養(yǎng)，按照所述方式傳代至P3-P5代。
[0020]其中，更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述單核細(xì)胞層可由以下方法分離獲得:
[0021]取正常人的骨髓樣本加入等體積生理鹽水混勻，然后用巴氏吸管吸取骨髓混合液加入到等體積的淋巴細(xì)胞分離液中，離心后用巴氏吸管吸取中間層的單核細(xì)胞層。
[0022]更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長培養(yǎng)基為含10% FBS以及10ng/mLbFGF的DMHM培養(yǎng)基。
[0023]在步驟2復(fù)蘇環(huán)節(jié)，將本發(fā)明所采用的條件培養(yǎng)基替代現(xiàn)有經(jīng)常采用的商業(yè)培養(yǎng)基，按照一般的做法復(fù)蘇即可。
[0024]作為優(yōu)選，步驟2為:
[0025]將凍存的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞放置在35_42°C的水浴鍋中，震蕩溫育30_60秒，然后加入到5-10倍體積的條件培養(yǎng)基中，以1000-2000rpm離心3_5分鐘，去上清，用條件培養(yǎng)基重懸沉淀，吹打混勻，并按照5000-10000/cm2的細(xì)胞密度用條件培養(yǎng)基放置在37°C、5%0)2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24小時(shí)后，更換條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80% -90%。
[0026]運(yùn)用本發(fā)明所述方法復(fù)蘇凍存的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，相比采用現(xiàn)有方法(《凍存復(fù)蘇后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和多向分化潛能研究》中記載的復(fù)蘇方法)復(fù)蘇后的細(xì)胞，其活力顯著提高，且依然保持間充質(zhì)干細(xì)胞良好的生物學(xué)特征，具有分化為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞的能力?；诖?，本發(fā)明提供了所述條件培養(yǎng)基在復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明所述條件培養(yǎng)基在不使用時(shí)可放置在-20°C培養(yǎng)箱保存6個(gè)月-12個(gè)月左右或放置在-80°C保存1年以上。需要使用時(shí)，恢復(fù)到37°C常溫使用。
[0027]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明以培養(yǎng)過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基上清為復(fù)蘇時(shí)的培養(yǎng)基，替代現(xiàn)有方法中普遍采用的諸如a -MEM, DMEM這種商業(yè)培養(yǎng)基，依靠其中包含的多種細(xì)胞在增殖過程中分泌的活性物質(zhì)來促進(jìn)復(fù)蘇后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長，進(jìn)而提尚其活力。
【附圖說明】
[0028]圖1所示為本發(fā)明復(fù)蘇方法和現(xiàn)有復(fù)蘇方法細(xì)胞復(fù)蘇后活力柱形圖；
[0029]圖2所示為本發(fā)明復(fù)蘇方法和現(xiàn)有復(fù)蘇方法細(xì)胞復(fù)蘇且培養(yǎng)72h后的細(xì)胞總數(shù)柱形圖；
[0030]圖3所示為空白組細(xì)胞表面抗原流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖；
[0031 ]圖4所示為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表面抗原流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖；
[0032]圖5所示為復(fù)蘇后細(xì)胞成骨誘導(dǎo)的鏡檢圖；
[0033]圖6所示為復(fù)蘇后細(xì)胞成脂誘導(dǎo)的鏡檢圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]本發(fā)明實(shí)施例公開了一種復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品及方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0035]為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種復(fù)蘇骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0036]實(shí)施例1:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及條件培養(yǎng)基的收集
[0037]將抽取的成體骨髓，用加入等體積的生理鹽水，然后用巴氏吸管吸取骨髓混合液加入到等體積的淋巴細(xì)胞分離液中，以2000轉(zhuǎn)離心10分鐘；離心后用巴氏吸管吸取中間層的單核細(xì)胞層。加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS+10ng/ml bFGF)重懸細(xì)胞沉淀，隨后放置在37°C，5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2-3天換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80% -90%，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心后用完全培養(yǎng)基重懸沉淀，5X103/cm2細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。取P3-P5代細(xì)胞進(jìn)行條件培養(yǎng)基收集。
[0038]條件培養(yǎng)基收集:用于條件培養(yǎng)基的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，先按照5X 103/cm2細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿，完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)后，用Hanks清洗后，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，將上清分裝于50mL離心管中，1000pm離心5min。去除沉淀，收集上清。用一次性注射器吸取條件培養(yǎng)基，用0.22 μπι濾膜過濾，收集在無菌收集瓶中。放置在-20°C培養(yǎng)箱保存6個(gè)月-12個(gè)月左右或放置在-80°C保存1年以上。需