抗藍(lán)舌病病毒ns1蛋白的群特異性單克隆抗體btv-ns1-1f11及其識(shí)別的b細(xì)胞表位和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株分泌抗1-24型藍(lán)舌病病毒NS1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株 及其所分泌的單克隆抗體；本發(fā)明還涉及由上述單克隆抗體所識(shí)別的BTVNS1蛋白的線性 B細(xì)胞表位；本發(fā)明還涉及上述雜交瘤細(xì)胞株、單克隆抗體以及線性B細(xì)胞表位在制備鑒別 診斷以及預(yù)防與治療BTV相關(guān)試劑與藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于藍(lán)舌病的防治領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)舌病病毒（Bluetonguevirus，BTV)是呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的典型成員。 BTV以庫(kù)蚊為媒介，通過叮咬野生和家養(yǎng)等反芻動(dòng)物，包括綿羊，山羊和牛，而使之感染。由 于BTV中存在大量的基因變異和抗原變異，目前世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)26種不同BTV血清型，且 各個(gè)血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)作用，這給藍(lán)舌?。˙T)的檢測(cè)和防控帶來(lái)了極 大的困難。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（0ΙΕ)將BT列為法定通報(bào)性疾病，我國(guó)將其劃定為一類動(dòng)物 疫病。
[0003] 本病于19世紀(jì)在南非的綿羊中首次發(fā)現(xiàn)，1905年被命名為"藍(lán)舌病"，現(xiàn)已確定 BTV有26個(gè)血清型。從1998年開始藍(lán)舌病病毒開始在全球范圍內(nèi)蔓延，主要發(fā)生在世界 上熱帶和溫帶范圍內(nèi)的大部分地區(qū)，其流行病學(xué)與作為BTV生物傳播載體的特定庫(kù)蠓的分 布相吻合。但是近幾年來(lái)由于全球氣候變暖，BT在全球范圍內(nèi)的流行趨勢(shì)不容樂觀。從 1998-2006年，BTV1、2、4、8、9以及16型擴(kuò)散傳播到地中海沿岸的歐洲地區(qū)。歐洲許多國(guó) 家如比利時(shí)、法國(guó)、德國(guó)、盧森堡和荷蘭等國(guó)家都有過BT爆發(fā)的報(bào)道，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損 失，這不僅包括因動(dòng)物死亡和繁殖能力降低而造成的直接損失，還包括在BTV感染區(qū)和非 感染區(qū)之間設(shè)立關(guān)卡、屏障而限制了反芻動(dòng)物及動(dòng)物制品交易而造成的間接損失。我國(guó) 于1979年首次在云南省師宗縣確定藍(lán)舌病的發(fā)生，之后相繼在湖北?。?983年）、安徽省 (1985年）、四川?。?989年）、山西?。?991年）爆發(fā)過本病。從1994-1997年，先后對(duì)我 國(guó)29個(gè)省區(qū)藍(lán)舌病血清學(xué)進(jìn)行調(diào)查，鑒定出BTV1、2,、3、4、12、15以及16等7個(gè)血清型， 其中BTV1、16型在自然感染發(fā)病綿羊體內(nèi)分離獲得，是主要的致病血清型。因此，應(yīng)加強(qiáng) 對(duì)國(guó)內(nèi)藍(lán)舌病流行病學(xué)監(jiān)控工作，同時(shí)完善監(jiān)測(cè)診斷技術(shù)，提高靈敏度，為我國(guó)藍(lán)舌病疫情 的防控奠定良好的基礎(chǔ)。
[0004] BTV基因組由十個(gè)線性雙鏈RNA組成。與呼腸孤病毒科的其他成員一樣，組裝在無(wú) 囊膜核心顆粒中的雙鏈RNA基因組片段轉(zhuǎn)錄為病毒的mRNA。利用轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中的RNA依賴 的RNA聚合酶（VP1蛋白）合成十個(gè)完全首尾相連病毒mRNA基因組片段，分別編碼7種結(jié) 構(gòu)蛋白（VP1~VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4)。NS1蛋白由S5基因編 碼，核苷酸長(zhǎng)1689bp，編碼552個(gè)氨基酸，蛋白大小為64kDa。通過對(duì)NS1蛋白的氨基酸 序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)NS1蛋白在BTV不同血清型之間高度保守，這表明NS1蛋白具有群特異 性抗原的特性。NS1蛋白在BTV感染宿主過程中具有遺傳和和抗原穩(wěn)定性，是BTV復(fù)制周 期中表達(dá)量最高的細(xì)胞質(zhì)蛋白，其多聚體能夠在感染細(xì)胞內(nèi)中形成大量的病毒特異性微管 (直徑52. 3nm，lOOOnm)，而這一特征在呼腸孤病毒科其他種屬中并沒有發(fā)現(xiàn)。NS1蛋白多聚 體上調(diào)包括NS1蛋白的所有病毒蛋白的合成，形成NS1表達(dá)的正反饋，進(jìn)而迅速增加所有病 毒蛋白的合成，使BTV感染哺乳動(dòng)物后，病毒蛋白的合成能夠迅速取代細(xì)胞蛋白的合成，成 為細(xì)胞質(zhì)中最多的細(xì)胞質(zhì)蛋白，感染后8個(gè)小時(shí)病毒蛋白即可成為主要的翻譯產(chǎn)物。綜上 所述，NS1蛋白在BTV引起細(xì)胞病變的過程中起重要作用。所以可以通過制備BTV1-24型 NS1蛋白的群特異性單克隆抗體并鑒定其B細(xì)胞表位建立BTV的快速準(zhǔn)確的鑒別診斷方法 并進(jìn)一步研究BTV1-24型的預(yù)防與治療措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的之一是提供一株分泌抗藍(lán)舌病病毒1-24型NS1蛋白單克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞株；
[0006] 本發(fā)明目的之二是提供一種由該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，該單克隆抗體 可與BTV1-24型的NS1蛋白均發(fā)生特異性反應(yīng)；
[0007] 本發(fā)明目的之三是鑒定藍(lán)舌病病毒NS1蛋白的線性B細(xì)胞表位。
[0008] 本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0009] 本發(fā)明利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化的重組BTV12-NS1蛋白作為 免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，以pET-30a原核 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化的重組NS1蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì) 胞，最終獲得一株穩(wěn)定分泌抗1-24型BTVNS1蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為 BTV-NS1-1F11，分類命名為分泌抗BTV-NS1-1F11單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏在中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其微生物保藏號(hào)是：CGMCCN0. 10208 ;保藏時(shí) 間：2014年12月23日；保藏地址是：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，命名為 BTV-NS1-1F11，IFA檢測(cè)結(jié)果表明該單克隆抗體與重組BTV12-NS1蛋白及感染BTV1-24的 BHK-21細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)，與相應(yīng)陰性對(duì)照均不發(fā)生反應(yīng)。
[0011] 本發(fā)明利用肽掃描技術(shù)對(duì)單克隆抗體BTV-NS1-1F11所識(shí)別的BTV12-NS1蛋白的 線性B細(xì)胞表位進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明：BTV-NS1-1F11所識(shí)別的BTV12-NS1蛋白的線性B細(xì) 胞表位的氨基酸序列為451KAQRSALLRLFCFVCY466(SEQIDN0. 1所示）。同時(shí)，序列比對(duì)特異 性鑒定結(jié)果顯示451KAQRSALLRLFCFVCY466為BTV1-24的群特異性表位。
[0012] 綜上所述，本發(fā)明制備并鑒定出了一株抗BTV1-24型NS1蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，實(shí) 驗(yàn)證明由該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體以及該單克隆抗體所識(shí)別的針對(duì)BTV的線性B 細(xì)胞表位可用于制備鑒別、診斷、預(yù)防或治療藍(lán)舌病病毒1-24型感染的試劑與藥物，本發(fā) 明的提出為建立BTV的鑒別診斷方法以及進(jìn)一步研究BTV的防治措施奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為pET-30a原核系統(tǒng)表達(dá)純化的重組BTV12-NS1蛋白的SDS-PAGE與Western blot(WB)鑒定；
[0014] 1 :pET-30a空載體；2 :重組BTV12-NS1蛋白超聲后沉淀；3 :重組BTV12-NS1蛋白 超聲后上清；4 :重組BTV12-NS1蛋白誘導(dǎo)后；5 :重組BTV12-NS1蛋白誘導(dǎo)前；6 :純化后的 重組BTV12-NS1蛋白（SDS-PAGE) ;7:純化的重組BTV12-NS1蛋白（WB) ;8:未純化的重組BTV12-NS1 蛋白（WB);M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker。
[0015] 圖2為Bac-to-Bac真核桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化的重組BTV12-NS1蛋白的 SDS-PAGE與Westernblot鑒定；
[0016] 1 :重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞的裂解產(chǎn)物；2 :重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞的裂 解產(chǎn)物上清；3 :重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞的裂解產(chǎn)物沉淀；4 :純化的BTV12NS1蛋白 (SDS-PAGE) ;5 :野生型桿狀病毒感染的Sf9昆蟲細(xì)胞；6 :純化的BTV12NS1蛋白（WB);M: 標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker。
[0017] 圖3為應(yīng)用IFA檢測(cè)單克隆抗體BTV-NS1-1F11與BTV1-24型病毒感染的BHK-21 細(xì)胞、未接毒的BHK-21細(xì)胞的反應(yīng)性結(jié)果；
[0018] 1 :BTVl-24 ;2 :鼠的陽(yáng)性血清3 :鼠的陰性血清；4 :未接毒的BHK-21細(xì)胞。
[0019] 圖4為應(yīng)用Westernblot檢測(cè)單克隆抗體BTV-NS1-1F11與真核重組重