二化螟致死基因csu-miR-260及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及二化螟致死基因csu-miR-260及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 二化螟Chilosuppressalis(Walker)屬鱗翅目，螟蛾科，是我國水稻上危害最為 嚴(yán)重的常發(fā)性害蟲之一。在我國，化學(xué)藥劑連續(xù)單一長期使用已導(dǎo)致二化螟對多種農(nóng)藥產(chǎn) 生了不同程度的抗性，需要不斷加大農(nóng)藥使用量才能達(dá)到滿意的防治效果，造成了更為嚴(yán) 重的環(huán)境污染，形成惡性循環(huán)。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，急需化學(xué)農(nóng)藥之外的替代防治手 段。
[0003] microRNAs(miRNAs)是一種小的，類似于siRNA的分子，由高等真核生物基因組編 碼，miRNA通過和靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯， 從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控生物的生長、發(fā)育、代謝。miRNAs在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在植物、 動(dòng)物和真菌中發(fā)現(xiàn)的miRNAs只在特定的組織和發(fā)育階段表達(dá)，miRNA的組織特異性和時(shí)序 性，決定組織和細(xì)胞的功能特異性，表明miRNA在細(xì)胞生長和發(fā)育過程中起多種調(diào)節(jié)作用。
[0004] 在生物體中，一些重要的基因?qū)S持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利 用miRNA類似物將農(nóng)業(yè)害蟲中重要基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，則會(huì)引起害蟲的致畸或致死，從 而達(dá)到控制害蟲的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的利用小RNA文庫（smallRNAlibrary)分析發(fā)現(xiàn)具有致死效果的 csu-miR-260〇
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供該miRNA的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 灰飛虱致死基因csu-miR-260,序列為 5' -UUUUGGAUGACUGGCCCAUGUCGGCGU-3'。
[0009] 所述的csu-miR-260是通過以下生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)的：
[0010] ⑴去除被污染的序列與無義序列，過濾掉短于18nt的序列，得到可標(biāo)注的干凈 數(shù)據(jù)；
[0011] (2)使用Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進(jìn)行序列比對，使 用Rfam(http://rfam.sanger.ac.uk)去除正義外顯子、反義外顯子、正義內(nèi)含子、反義內(nèi) 含子、rRNA、tRNA等。使用RepBase(www.girinst.org/repbase)去除重復(fù)序列；
[0012] (3)在已知二化螟基因組（http://ento.njau.edu.cn/ChiloDB/)的情況下，使用 miRDeep預(yù)測miRNA。先用MegaBlast(http://www.mega-blast.com/)將處理后的小RNA 文庫序列映射到基因組上，再使用miRDe印，以默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行miRNA預(yù)測；
[0013] (4)為了分析miRNA的家族與保守性，我們使用Patscan，以211參數(shù)將二化螟成 熟體miRNA與miRBaseversion19. 0上的已知miRNA進(jìn)行比對，最終獲得csu-miR-260。
[0014] 本發(fā)明所述的csu-miR-260在制備二化螟滅蟲試劑中的應(yīng)用。
[0015] -種二化螟滅蟲方法，用所述的csu-miR-260的溶液在二化螟幼蟲的上背部或側(cè) 面進(jìn)行注射或使用所述的csu-miR-260喂食二化螟。
[0016] 所述的滅蟲方法，優(yōu)選包含以下步驟：
[0017] (1)用無核酸酶水稀釋所述的csu-miR-260至濃度為200pmol/μL;
[0018] (2)選取合適天數(shù)的二化螟幼蟲，在上背部或側(cè)面，使用微量注射器注射0. 5μL/ 頭csu-miR-260 溶液；
[0019] (3)用針頭挑起蟲體，等待一段時(shí)間，待csu-miR-260已混入幼蟲血腔，輕輕拔出 針頭。
[0020] 有益效果：
[0021] 本發(fā)明闡述了完整的miRNA生物信息學(xué)分析，從海量的小RNA文庫數(shù)據(jù)中搜尋到 一條有效miRNA--csu-miR-260 〇
[0022] 利用體外合成的csu-miR-260注射二化螟，對二化螟具有明顯的致死效果，說明 該miRNA基因可作為二化螟重要基因的有效干擾物。
[0023] 本發(fā)明合成的csu-miR-260能有效抑制二化螟體內(nèi)重要基因的表達(dá)，更好地抵抗 RNA酶的降解，同時(shí)合成成本較低，便于大量實(shí)驗(yàn)使用。
【附圖說明】
[0024] 圖1csu-miR-260注射實(shí)驗(yàn)致死率統(tǒng)計(jì)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 實(shí)施例1
[0026] (1)化學(xué)合成二化螟致死基因csu-miR-260,序列為 5'-UUUUGGAUGACUGGCCCAUGUC GGCGU-3'（SEQIDNO. 1);
[0027] (2)使用高效液相色譜法（HPLC)進(jìn)行純化；
[0028] (3)使用分光光度計(jì)精確定量，凍干保存。
[0029] 實(shí)施例2
[0030] 一種二化螟的致死基因csu-miR-260注射方法，包含如下步驟：
[0031] (1)用無核酸酶水稀釋所述的csu-miR-260至濃度為200pmol/μL;
[0032] (2)選取合適天數(shù)的二化螟幼蟲，在上背部或側(cè)面，使用微量注射器注射0. 5μL/ 頭csu-miR-260 溶液；
[0033] (3)用針頭挑起蟲體，等待一段時(shí)間，待csu-miR-260已混入幼蟲血腔，輕輕拔出 針頭；
[0034] (4)將注射后的幼蟲放置在12孔板中，加入適量水稻苗，蓋上蓋子，用橡皮筋捆 好，每隔6小時(shí)觀察表型，結(jié)果如圖1所示，可見csu-miR-260注射二化螟，對二化螟具有明 顯的致死效果，說明該miRNA基因可作為二化螟重要基因的有效干擾物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1?二化螟致死基因 csu-miR-260,序列為 5' -UUUUGGAUGACUGGCCCAUGUCGGCGU-3'。2. 權(quán)利要求1所述的csu-miR-260在制備二化螟滅蟲試劑中的應(yīng)用。3. -種二化螟滅蟲方法，其特征在于用權(quán)利要求1所述的csu-miR-260的溶液在二化 螟幼蟲的上背部或側(cè)面進(jìn)行注射或使用權(quán)利要求1所述的csu-miR-260喂食二化螟。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的滅蟲方法，其特征在于包含以下步驟： (1) 用無核酸酶水稀釋權(quán)利要求1所述的csu-miR-260至濃度為200pmol/ii L ; (2) 選取合適天數(shù)的二化螟幼蟲，在上背部或側(cè)面，使用微量注射器注射0. 5 y L/頭 csu-miR-260 溶液； ⑶用針頭挑起蟲體，等待一段時(shí)間，待csu-miR-260已混入幼蟲血腔，輕輕拔出針頭。
【專利摘要】本發(fā)明公開了二化螟致死基因csu-miR-260及其應(yīng)用。二化螟致死基因csu-miR-260，序列為5’-UUUUGGAUGACUGGCCCAUGUCGGCGU-3’。本發(fā)明所述的csu-miR-260在制備二化螟滅蟲試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明利用完整的miRNA生物信息學(xué)分析，為從海量的小RNA文庫數(shù)據(jù)中搜尋到一條有效miRNA——csu-miR-260。利用體外合成的csu-miR-260注射二化螟，對二化螟具有明顯的致死效果，說明該miRNA可作為二化螟重要基因的有效干擾物。
【IPC分類】A01N57/16, C12N15/113, A01P7/04
【公開號(hào)】CN105238785
【申請?zhí)枴緾N201510674016
【發(fā)明人】李飛, 王書平, 葛暢, 孫楊, 肖花美
【申請人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年10月16日