一種雞樅菌的dna條形碼標準基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及物種鑒定領域，具體涉及一種雞樅菌的DNA條形碼標準基因及其應 用。
【背景技術】
[0002] 雞樅，隸屬真菌類擔子菌綱傘菌目傘菌科。我們常說的雞樅菌是一類與大白蟻亞 科(Macrotermitinae)的某些種特異性共生的真菌，故又名蟻巢傘或白蟻傘。雞縱菌被稱 為野生食用菌之王，其肉質肥厚、質細絲白、脆嫩爽□、清香鮮美、營養(yǎng)豐富，含有I丐、鎂、鐵、 蛋白質等多種營養(yǎng)成分，富含磷，含有20多種氨基酸。此外，雞樅菌中還含有治療糖尿病的 有效成分，對降低血糖有明顯的效果。雞樅菌是人們食用和送禮的首選，市場需要在逐年增 加。最新版的《真菌字典》（Ainsworth Bisby's Disctionary of the Fungi)共記錄和描 述了全世界的40個雞樅菌物種，而云南地區(qū)的雞樅菌物種就達到20種，可見云南地區(qū)雞 樅菌種類之豐富。據估計，云南每年的雞樅菌產量在2000噸左右。但是，近年來由于市場 需求加大，雞樅菌的自然群體面臨著被過度采摘的威脅；加之隨著生態(tài)環(huán)境的破壞，雞樅菌 的棲息環(huán)境正在變得越來越少，野生雞樅菌種質資源受到了嚴重的威脅，對野生雞樅菌的 保護迫在眉睫。另一方面，由于對雞樅種質資源缺乏系統(tǒng)的認知，雞樅菌市場上種類魚目混 雜，優(yōu)劣不等，不良商販以次充好、以假充真的現象屢見不鮮。民間多根據雞樅的顏色，分為 黑皮、白皮、黃皮、花皮等許多類型，味道以黑皮(青皮）雞樅最好，有人還根據雞樅菌蓋的形 狀分類，認為質量最好的是蒜頭雞樅，次為開雞樅，再次為火把雞樅，但是這些形態(tài)特征多 受到雞樅發(fā)育程度和生長環(huán)境的影響，帶有極大的人為因素。另外，由于公眾缺乏對野生雞 樅菌的準確鑒別能力，食用毒蘑菇導致死亡的事件時有發(fā)生。因此，急需建立其分子鑒定方 法，通過形態(tài)型劃分與分子數據分析相結合的方法來解決其鑒別和分類問題，并通過這些 分子數據研究其遺傳多樣性，揭示雞樅菌在云南地區(qū)的遺傳分布和群體結構，為雞樅菌的 資源保護提供理論參考。

【發(fā)明內容】

[0003]為克服形態(tài)學鑒定雞樅菌存在的缺陷，本發(fā)明提供了一種雞樅菌分子鑒定的標準 基因序列及鑒定方法，可以快速準確地將該物種從易混淆物種或復合種中鑒定出來。
[0004]為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案如下： 一種雞樅菌的DNA條形碼標準基因序列SEQ ID NO. 1 : ATCTTCGTCGATGTAACACGCCCCTAGGACGAGAGGGCAAGATTGCCAAACCCCGTCAATTGCATAATACC CATTGGGGAATGGTCTGYCCCGCGGAGACGCCAGAAGGTCAAGCGTGTGGACTCGTTAAAAATCTTGCTCTAATGT CATGCATCTCTGTCGGGTCATACTCTGCACCTGTTATTGAATTTTTAGAGGAGTGGGGTTTGGAGTCACTGGAAGAA AATGCTCATTCTTCCACTCCTTGCACAAAGGTCTTTGTTAATGGTGTCTGGATGGGCGTCCATCGCGATCCCGCAAA CTTGGTGAAGACTATCAAAAAGTTGCGACGCAAAGACGACATAAGTCCTGAAGTTTCTGTTGTACGGGATATCAGGG AAAAAGAACTACGGCTCTACACAGACGCTGGCCGCGTCTGCCGGCCCCTGTTTATCGTGGAAAATCAACAGCTTGCG CTTGAGAAGAAGCACGTTCGCTGGCTCAGCAACGGGAAAGATGATAACGGAGCTGAGTACAAATGGGAATCGTTGGT CAAGGGTGGCGTAGTCGAGCTCTTGGAT GCAGAAGAGGAGGAAACAGTTATGATATCAATGACTCCAGAAGATCTTGARACTTCCAGATTGCAACAGAGTG GTGTCAACCCCGCTGTTAATGAAGATTTTGACCCTGCAGCTCGACTCAAAGCCGGAATCAACTCACAC〇
[0005] 應用權利要求1所述的標準基因進行分子鑒定方法包括以下4個步驟： (1) 從樣品組織中分離提取基因組DNA; (2) 以步驟（1)所提取的基因組DNA為模板，用雞樅菌RPB2特異性引物，進行聚合酶 鏈式反應； (3) 對步驟（2)擴增得到的DNA產物進行測序； (4) 將測序結果進行手工拼接，與所述基因序列RPB2的進行同源性比對，若同源性在 99%以上，即可將該樣品鑒定為雞縱菌（cXrjOeaiiAs·)。
[0006] 進一步，所述的RPB2特異性引物的引物序列為： RPB2B-f: 5' -CCGCAAAGGCTGGTGTATC-3' ， RPB2B-r: 5? -TTCGAATGAGTTCAAGTGT-3?； 進一步，所述聚合酶鏈式反應，其擴增條件為95°C預變性3min，接下來94°C變性30s， 50°C退火1min，72°C延伸1. 5min，一共進行30-35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0007] (1)根據DNA條形碼技術原理，采用PCR擴增方法，確保條帶的純度及可靠性。測 序結果通過手工校對、序列拼接，并確保所得序列為標準序列。從采集的雞樅菌樣品提取基 因組DNA，利用引物進行聚合酶鏈式反應（PCR)擴增出樣品的RPB2基因，將擴增產物測序后 分析比對，優(yōu)選SEQIDNO. 1引物序列擴增樣品的RPB2基因序列片段作為標準基因。為了 實現上述目的，一種用于雞樅菌分子鑒定標準檢測基因如下所述的基因序列SEQIDNO. 1 : ATCTTCGTCGATGTAACACGCCCCTAGGACGAGAGGGCAAGATTGCCAAACCCCGTCAATTGCATAATACC CATTGGGGAATGGTCTGYCCCGCGGAGACGCCAGAAGGTCAAGCGTGTGGACTCGTTAAAAATCTTGCTCTAATGT CATGCATCTCTGTCGGGTCATACTCTGCACCTGTTATTGAATTTTTAGAGGAGTGGGGTTTGGAGTCACTGGAAGAA AATGCTCATTCTTCCACTCCTTGCACAAAGGTCTTTGTTAATGGTGTCTGGATGGGCGTCCATCGCGATCCCGCAAA CTTGGTGAAGACTATCAAAAAGTTGCGACGCAAAGACGACATAAGTCCTGAAGTTTCTGTTGTACGGGATATCAGGG AAAAAGAACTACGGCTCTACACAGACGCTGGCCGCGTCTGCCGGCCCCTGTTTATCGTGGAAAATCAACAGCTTGCG CTTGAGAAGAAGCACGTTCGCTGGCTCAGCAACGGGAAAGATGATAACGGAGCTGAGTACAAATGGGAATCGTTGGT CAAGGGTGGCGTAGTCGAGCTCTTGGAT GCAGAAGAGGAGGAAACAGTTATGATATCAATGACTCCAGAAGATCTTGARACTTCCAGATTGCAACAGAGTG GTGTCAACCCCGCTGTTAATGAAGATTTTGACCCTGCAGCTCGACTCAAAGCCGGAATCAACTCACAC〇
[0008] (2)樣品的鑒別：通過將待鑒別的樣品序列與標準基因進行比對，基于同源性和基 于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設立鑒定規(guī)則來鑒別物種，獲得序列間的相似性，相似度最高 或匹配度最高或遺傳距離最近的對應物種即為待鑒別的物種；具體如下： a.基于同源性鑒定規(guī)則來鑒別物種 根據測序結果，如果與所述基因序列SEQIDNO. 1的同源性在99%以上，即可判斷所述 的待測樣品為尖盾白蟻傘（c乂
[0009]b.基于聚類分析的系統(tǒng)發(fā)生樹法設立鑒定規(guī)則來鑒別物種 將標準基因序列和待鑒定的樣品序列與雞樅菌其他種內的RPB2序列合并應用MEGA或 PAUP軟件構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，檢驗未鑒定樣品的DNA條形碼序列與標準基因序列聚類在 一起的物種，若未知樣品與數據庫中的物種構成單支系，則鑒定為該物種。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點在于： 1、優(yōu)選RPB2基因作為最適合鑒別尖盾白蟻傘（