一種檢測(cè)人idh1基因突變的探針?lè)捌湓噭┖械闹谱鞣椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)基因突變的方法及其試劑盒，特別涉及一種檢測(cè)人IDH1基 因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman探針?lè)捌湓噭┖小?br>【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡(jiǎn)稱膠質(zhì)瘤，是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占所有顱內(nèi)原 發(fā)腫瘤的一半，廣義上是指所有神經(jīng)上皮來(lái)源的腫瘤，狹義上則是指源于各類膠質(zhì)細(xì)胞的 腫瘤。通用WHO分級(jí)根據(jù)非典型性、核分裂指數(shù)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和壞死程度分為4級(jí)：1級(jí)： 以良性毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤為主，占膠質(zhì)瘤5%左右，通?？梢灾斡?；II級(jí)：為一般的星形 細(xì)胞瘤或混合性少突星形細(xì)胞瘤，占膠質(zhì)瘤的30~40%左右；III級(jí)：為間變型星形細(xì)胞 瘤，占膠質(zhì)瘤的15~25%左右，一般由II級(jí)演變而來(lái)；IV級(jí)：為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，占膠質(zhì)瘤的 1/3左右。低級(jí)別的膠質(zhì)瘤在臨床上主要是指WHO分類為星形細(xì)胞瘤I與II級(jí)，也包括少 突膠質(zhì)細(xì)胞瘤及混合性少突星形細(xì)胞瘤。
[0003] 異檸檬酸脫氫酶（IDH)家族包括以NAD或NADP為輔助因子，催化異檸檬酸的氧化 脫羧反應(yīng)生成α-酮戊二酸的酶類，同時(shí)分別生成NADH或NADPH。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，IDH 同工酶有以下三種形式：依賴NAD的線粒體IDH1，依賴NADP的線粒體IDH2,依賴NADP的胞 質(zhì)IDH3。編碼依賴NAD的人IDH1的IDH1基因位于染色體2q33. 3,并且定位于細(xì)胞質(zhì)和 過(guò)氧化物酶體中；編碼依賴NADP的線粒體IDH2酶的IDH2基因位于染色體15q26. 1。盡管 IDH1和IDH2都參與了細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的防御機(jī)制，但I(xiàn)DH1在脂質(zhì)的代謝機(jī)制中也發(fā)揮了 重要作用。
[0004] 大量研究證實(shí)，代謝的異常是引發(fā)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的因素之一。IDH基因突變發(fā)生 在腫瘤的早期，并且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的IDH基因高度保持一致。一般認(rèn)為，IDH基因狀態(tài)不 會(huì)因治療而發(fā)生變化。IDH基因在多種腫瘤中發(fā)生了突變，其發(fā)生率在結(jié)直腸癌約為40%， 胰腺癌為90%以上，肺癌約為15%。IDH1基因突變主要集中發(fā)生在第2外顯子的12和13 密碼子R>H(彡90% )稱為R132H，這些突變破壞了IDH1蛋白內(nèi)在的GTPase活性，從而使 得IDH1蛋白處于持續(xù)活性狀態(tài)。美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN)臨床實(shí)踐指南（第二版， 2014)將有無(wú)IDH1/2基因突變作為評(píng)估低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別的指標(biāo)之一。
[0005] 以往膠質(zhì)瘤診斷及其分級(jí)主要依賴組織病理學(xué)，但僅靠組織形態(tài)學(xué)，特別是立體 定向取材小標(biāo)本，使組織缺乏典型病變，常常不能根據(jù)腫瘤的密度、異型性、血管增生、壞死 等進(jìn)行分級(jí)。當(dāng)取材為腫瘤（尤其是低級(jí)別膠質(zhì)瘤）邊緣，或腫瘤治療后判斷是否存在復(fù) 發(fā)情況時(shí)，區(qū)分這些膠質(zhì)細(xì)胞是腫瘤還是反應(yīng)性增生就顯得十分困難。而直接測(cè)序法檢測(cè) 基因突變則存在步驟繁瑣、工序復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的不足。而本發(fā)明采用的熒光定量PCR方法 是分子診斷領(lǐng)域應(yīng)用的一種技術(shù)，該方法靈敏度高、可實(shí)時(shí)定量，是適合臨床大規(guī)模使用的 方法。
[0006] 本發(fā)明還結(jié)合了擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（amplificationrefractorymutation system，ARMS)ARMS于1989年建立，用于對(duì)已知突變基因進(jìn)行檢測(cè)。由于PCR過(guò)程中引物 延伸是3'端開(kāi)始的，所以3'末端的堿基對(duì)引物的延伸來(lái)說(shuō)非常重要。根據(jù)這個(gè)原理，將突 變與正常等位基因所不同的那個(gè)堿基安排在引物3'最末端，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，如果引物3'末 端堿基與模板DNA序列匹配則可以擴(kuò)增，如果不匹配，則鏈延伸反應(yīng)就會(huì)因3'，5' -磷酸二 酯鍵形成障礙而受阻，從而達(dá)到區(qū)分檢測(cè)等位基因的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了實(shí)現(xiàn)對(duì)人IDH1基因突變的檢測(cè)，從而為腫瘤病理分型、預(yù)后判斷提供參考， 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)人IDH1基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman探針?lè)捌湓噭┖校?該探針?lè)ê驮噭┖袨榕R床上提供了一種速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的IDH1基因突變檢測(cè) 體系。
[0008] -種檢測(cè)人IDH1基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCR Taqman探針?lè)ǎㄒ韵虏襟E：
[0009] (1)在IDH1R132H PCR反應(yīng)混合液中加入從樣品中提取的、作為模板的人類基因 組DNA，形成R132H反應(yīng)體系并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，其中：
[0010] 所述IDH1R132HPCR反應(yīng)混合液中包括溶解在PCR預(yù)混液中的以下組分：具有如 序列表中SEQIDNo. 1所示序列的IDH1R132H上游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 2所 示序列的IDH1R132H下游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的IDH1R132H探針、 具有如序列表中SEQIDNo. 4所示序列的內(nèi)參上游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 5所 示序列的內(nèi)參下游引物和具有如序列表中SEQIDNo. 6所示序列的內(nèi)參探針；
[0011] (2)結(jié)果判斷：根據(jù)人類基因組DNA在R132H反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增時(shí) 的突變Ct值進(jìn)行分析。
[0012] -種檢測(cè)人IDH1基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman探針?lè)ǎ鰳悠房梢允?利用腦膠質(zhì)瘤樣本術(shù)后冰凍組織或者石蠟組織或者活檢穿刺組織作為檢測(cè)標(biāo)本，包括：間 變性少突膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、少突細(xì)胞瘤、部分腦膠質(zhì)瘤前體組織和少量 正常腦組織、垂體瘤組織樣本。
[0013] 一種檢測(cè)人IDH1基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman探針?lè)?，其中R132H反應(yīng) 體系為：在16-20μ1IDH1R132HPCR反應(yīng)混合液中加入1-4μ1、濃度為3-10ng/μ1的人 類基因組DNA，優(yōu)選在18μ1IDH1R132HPCR反應(yīng)混合液中加入2μ1、濃度為10ng/μ1的 人類基因組DNA ;所述IDH1R132HPCR反應(yīng)混合液中各組分在PCR預(yù)混液中的濃度為：所 述IDH1R132H上游引物的濃度為2-4μΜ，優(yōu)選3μΜ ;所述IDH1R132H下游引物的濃度為 2-4μ Μ，優(yōu)選3μ Μ ;所述IDH1R132H探針的濃度為2-4μ Μ，優(yōu)選3μ Μ ;所述內(nèi)參上游引物的 濃度為1-3μΜ，優(yōu)選2μΜ ;所述內(nèi)參下游引物的濃度為1-3μΜ，優(yōu)選2μΜ ;所述內(nèi)參探針 的濃度為1-3μ Μ，優(yōu)選2μ Μ。
[0014] 一種檢測(cè)人IDH1基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman探針?lè)?，其中PCR的擴(kuò)增 過(guò)程為：37°C3min;95°C3min;95°C15s，65°C45s，14 個(gè)循環(huán)；95°C15s，60°C45s，24 個(gè)循 環(huán)，在60°C45s階段收集熒光。
[0015] -種檢測(cè)人IDH1基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCR Taqman探針?lè)ǎ渲薪Y(jié)果判斷步 驟中Ct值進(jìn)行分析為：
[0016] 當(dāng)R132H反應(yīng)體系中的內(nèi)參R0X信號(hào)呈現(xiàn)"S"曲線、內(nèi)參擴(kuò)增曲線10彡Ct彡14 時(shí)，可以判斷待測(cè)樣本R132H突變的陰性和陽(yáng)性：當(dāng)R132H反應(yīng)體系中的ΛCt< 9時(shí)為 R132H突變陽(yáng)性；當(dāng)R132H反應(yīng)體系中ΛCt>9時(shí)為R132H突變陰性，其中ΛCt=待測(cè)樣品 擴(kuò)增曲線的Ct值-內(nèi)參擴(kuò)增曲線的Ct值。
[0017] 一種檢測(cè)人IDH1基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman探針?lè)?，其中IDH1R132H PCR反應(yīng)混合液的PCR預(yù)混液中還溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR預(yù) 混液中的濃度為0. 05-0. 8μM，優(yōu)選0. 2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR預(yù)混液中的濃 度為 0· 005-0. 02U/μ1，優(yōu)選 0· 01U/μ1。
[0018] -種檢測(cè)人IDH1基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman探針?lè)?，還使用了弱陽(yáng)性 對(duì)照液和/或空白對(duì)照液，所述弱陽(yáng)性對(duì)照液為IDH1R132H突變率為10 %的人類基因組 DNA，或者是按照如下方法制備的弱陽(yáng)性對(duì)照液：含有IDH1R132H突變的陽(yáng)性質(zhì)粒溶解在沒(méi) 有IDH1R132H突變的人類基因組DNA水溶液中，使得陽(yáng)性質(zhì)粒與沒(méi)有IDH1R132H突變的人 類基因組DNA的拷貝數(shù)為1:9，陽(yáng)性質(zhì)粒與沒(méi)有R132H突變的人類基因組DNA在弱陽(yáng)性對(duì)照 液中的核酸總濃度為2-10ng/μ1，優(yōu)選為10ng/μ1 ;所得水溶液與IDH1R132H突變率10% 的人類基因組DNA按照本發(fā)明中的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman探針?lè)?、在相同的反?yīng)體系和 擴(kuò)增條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線吻合。所述空白對(duì)照液是TE緩沖液。
[0019] 一種檢測(cè)人IDH1基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman探針?lè)?，?6-20μ1，優(yōu)選 18μ1的IDH1R132HPCR反應(yīng)混合液中加入1-4μ1，優(yōu)選2μ1的弱陽(yáng)性對(duì)照液，形成R132H 反應(yīng)體系的陽(yáng)性質(zhì)控反應(yīng)體系，并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。
[0020] 一種檢測(cè)人IDH1基因突變的實(shí)時(shí)熒光定量PCRTaqman探針?lè)?，?6-20μ1，優(yōu)選 18μ1的IDH1R132HPCR反應(yīng)混合液中加入1-4μ1，優(yōu)選2μ1的空白對(duì)照液，形成R132H 反應(yīng)體系的空白對(duì)照反應(yīng)體系，并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。
[0021] -種檢測(cè)人IDH1基因突變的試劑盒，包括IDH1R132HPCR反應(yīng)混合液，其中所 述IDH1R132HPCR反應(yīng)混合液中包括溶解在PCR預(yù)混液中的以下組分：具有如序列表中 SEQIDNo. 1所示序列的IDH1R132H上游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 2所示序列的 IDH1R132H下游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 3所示序列的IDH1R132H探針、具有如序 列表中SEQIDNo. 4所示序列的內(nèi)參上游引物、具有如序列表中SEQIDNo. 5所示序列的 內(nèi)參下游引物和具有如序列表中SEQIDNo. 6所不序列的內(nèi)參探針。
[0022] -種檢測(cè)人IDH1基因突變的試劑盒，其中所述IDH1R132HPCR反應(yīng)混合液中各組 分在PCR預(yù)混液中的濃度為：所述IDH1R132H上游引物的濃度為2-4μM，優(yōu)選3μΜ;所述 IDH1R132H下游引物的濃度為2-4μΜ，優(yōu)選3μΜ;所述IDH1R132H探針的濃度為2-4μΜ， 優(yōu)選3μΜ;所述內(nèi)參上游引物的濃度為1-3μΜ，優(yōu)選2μΜ;所述內(nèi)參下游引物的濃度為 1-3μΜ，優(yōu)選2μΜ;所述內(nèi)參探針的濃度為1-3μΜ，優(yōu)選2μΜ。
[0023