用于檢測囊性纖維化病的方法
【專利說明】用于檢測囊性纖維化病的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于同時(shí)測定囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)物（CFTR)核酸中的突變、缺失、重 復(fù)和單核苷酸多態(tài)性的存在或缺乏的方法。還公開了用于擴(kuò)增CFTR核酸的區(qū)域以進(jìn)行高 通量大規(guī)模并行測序的核苷酸序列（諸如對(duì)于引物）及測定個(gè)體的囊性纖維化病狀態(tài)的方 法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 提供本發(fā)明背景的以下描述僅作為理解本發(fā)明的幫助，而并不承認(rèn)描述或構(gòu)成本 發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0004] 囊性纖維化病（CF)是高加索裔群體中的最常見的重度常染色體隱性遺傳病癥。 它在北美影響著2, 500個(gè)活產(chǎn)中的約1個(gè)（Boat等，TheMetabolicBasisofInherited Disease,第6版，pp2649-2680，McGrawHill，NY(1989))。25個(gè)人中的約 1 個(gè)是該疾病的 攜帶者。囊性纖維化病的主要癥狀包括慢性肺疾病、胰腺外分泌不足、和升高的汗液電解質(zhì) 水平。癥狀與作為外分泌病癥的囊性纖維化病一致。雖然最近的進(jìn)展已經(jīng)在分析離子轉(zhuǎn)運(yùn) 通過CF患者細(xì)胞的上皮的頂膜方面做出，但是不清楚氯化物通道的異常調(diào)節(jié)代表疾病中 的主要缺陷。
[0005]CF的基因已經(jīng)定位于染色體7的長臂上存在的250, 000個(gè)堿基對(duì)基因組序列。此 序列編碼稱作"囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)物"（或"CFTR"）的膜結(jié)合蛋白。CFTR基因中有大于 1000種不同突變，其在目前對(duì)囊性纖維化病遺傳分析協(xié)會(huì)報(bào)告的群體中具有不同的出現(xiàn)頻 率。這些突變存在于CFTR基因的編碼區(qū)（例如AF508(-種存在于約70%CF等位基因 上的突變）代表殘基508處的苯丙氨酸缺失）和非編碼區(qū)（例如5T、7T、和9T突變對(duì)應(yīng)于 位于內(nèi)含子8的剪接分支/接受位點(diǎn)處的5、7或9個(gè)胸苷堿基的序列）兩者中。CFTR基 因組和cDNA序列的比較確認(rèn)27個(gè)外顯子的存在。外顯子編號(hào)為1-27,如NCBI參照序列 登錄號(hào)NM_000492. 3中顯示。每個(gè)外顯子側(cè)翼有共有GT-AG剪接位點(diǎn)序列，如先前報(bào)告的 (Zielenski等，（1991)Genomics10,214_228)〇
[0006] 已經(jīng)描述了用于檢測CFTR基因突變的方法。參見例如Audrezet等，"Genomic rearrangementsintheCFTRgene:extensiveallelicheterogeneityanddiverse mutationalmechanisms"HumMutat. 2004Apr；23(4):343-57；Spiegelman和Lem的 PCTW0 1004/040013A1 及相應(yīng)的美國申請(qǐng) #20040110138 ;題為"Methodforthe detectionofmultiplegenetictargets"；Dunlop等的美國專利申請(qǐng)No. 20030235834; 題為"Approachestoidentifycysticfibrosis" ；及Ν·Broude的美國專利申請(qǐng) No. 20040126760,題為"Novelcompositionsandmethodsforcarryingoutmultiple PCRreactionsonasinglesample"。
[0007] 然而，目前必須采用多種不同分析和/或檢測方法以精確獲得全面序列數(shù)據(jù)。例 如，可以采用傳統(tǒng)的Sanger測序方法來測定牽涉CFTR基因中的少量核苷酸的突變的存在 或缺乏。然而，Sanger測序不能檢測大缺失和重復(fù)，諸如那些牽涉一個(gè)或多個(gè)外顯子的。因 此，需要?jiǎng)e的方法如定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QF-PCR)來檢測這些較大的突變類型。
[0008] 因而，需要改善的方法來有效檢測CF下面的多種CFTR基因缺陷以及同時(shí)捕捉劑 量數(shù)據(jù)（例如基因拷貝數(shù)）和序列數(shù)據(jù)兩者。此外，需要改善的方法來檢測CFTR基因中的 罕見突變。理想地，可在單一測定法中檢測多種類別的CFTR突變，如牽涉小堿基變化（例 如錯(cuò)義突變、無義突變、小插入或缺失和/或剪接位點(diǎn)突變）的那些及牽涉較大缺失和/或 重復(fù)的那些的方法是期望的。
[0009]發(fā)明概述
[0010] 提供了用于測定樣品CFTR核酸的核苷酸序列的方法，該方法（a)通過擴(kuò)增所述樣 品CFTR核酸的多個(gè)靶區(qū)段而生成銜接頭標(biāo)簽化的擴(kuò)增子文庫，并（b)通過使用高通量大規(guī) 模并行測序?qū)λ鰯U(kuò)增子文庫中的擴(kuò)增子測序來測定所述靶區(qū)段的核苷酸序列。
[0011] 還提供了用于測定樣品CFTR核酸中的CFTR核苷酸序列變體的存在或缺乏的方 法，其包括：(a)通過擴(kuò)增所述樣品CFTR核酸的多個(gè)靶區(qū)段生成銜接頭標(biāo)簽化的擴(kuò)增子文 庫；(b)通過使用高通量大規(guī)模并行測序?qū)λ鰯U(kuò)增子文庫中的擴(kuò)增子測序來測定所述靶 區(qū)段的核苷酸序列；（c)比較步驟（b)中測定的每個(gè)靶區(qū)段核苷酸序列與參照CFTR核苷酸 序列的相應(yīng)區(qū)域；并（d)如果或者當(dāng)一個(gè)或多個(gè)所述靶區(qū)段序列不同于所述參照CFTR核苷 酸序列的相應(yīng)區(qū)域時(shí)，那么確定所述樣品CFTR核酸具有變體序列。
[0012] 序列變體是不同于參照CFTR核酸序列的相應(yīng)區(qū)的CFTR序列。CFTR序列中的此 類差異可包括點(diǎn)突變、插入缺失和/或重復(fù)或拷貝數(shù)變化（CNV)。CNV是物種的兩個(gè)個(gè)體間 的 >50bp的基因組序列的獲得和缺少（Mills等 2011，Mappingcopynumbervariationby population-scalegenomesequencing，Nature470:59 - 65)。如果在PCR的指數(shù)期期間 的文庫生成過程中停止擴(kuò)增，那么可以在通過使用讀段深度（即定位密度）方法使用下一 代測序時(shí)測定此類變異。相對(duì)于正常樣本的所有其它擴(kuò)增子的正常劑量會(huì)是1、1/2 (對(duì)于 純合缺失）和1V2 (對(duì)于純合重復(fù)）。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，參照CFTR核酸序列包含野生型CFTR核酸序列。在一些實(shí)施 方案中，序列變體包含與囊性纖維化病有關(guān)的CFTR核苷酸序列突變。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于測定與參照CFTR核苷酸序列相比樣品CFTR核酸 中的堿基變化、基因缺失和基因重復(fù)的存在或缺乏的方法，所述方法包括：(a)通過擴(kuò)增所 述樣品CFTR核酸的多個(gè)靶區(qū)段生成銜接頭標(biāo)簽化的擴(kuò)增子文庫，（b)通過使用高通量大規(guī) 模并行測序?qū)λ鰯U(kuò)增子測序來測定所述靶區(qū)段的核苷酸序列，（c)比較步驟（b)中測定 的每個(gè)靶區(qū)段序列與參照CFTR核苷酸序列的相應(yīng)區(qū)域；并（d)如果或者當(dāng)一個(gè)或多個(gè)所述 靶區(qū)段序列不同于所述參照CFTR核苷酸序列的相應(yīng)區(qū)域時(shí)，那么確定所述樣品CFTR核酸 中存在一個(gè)或多個(gè)堿基變化、基因缺失和/或基因重復(fù)。在一些實(shí)施方案中，參照CFTR序 列由野生型CFTR核酸序列組成或可替換地包含野生型CFTR核酸序列。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用于診斷個(gè)體中的囊性纖維化病的遺傳基礎(chǔ)的方法， 其包括：(a)通過從所述個(gè)體中擴(kuò)增CFTR核酸的多個(gè)靶區(qū)段而生成銜接頭標(biāo)簽化的擴(kuò)增子 文庫，（b)通過使用高通量大規(guī)模并行測序?qū)λ鰯U(kuò)增子測序來測定所述靶區(qū)段的核苷酸 序列，并（c)如果或當(dāng)一個(gè)或多個(gè)所述靶區(qū)段的核苷酸序列含有與囊性纖維化病有關(guān)的突 變時(shí)，那么確定所述個(gè)體具有囊性纖維化病的遺傳基礎(chǔ)。與囊性纖維化病有關(guān)的遺傳突變 是本領(lǐng)域中公知的，并且包括罕見的和常見的突變兩者。
[0016] 在本發(fā)明的任何方面中，可使用讀段深度方法（readdepthapproach)進(jìn)行高通 量大規(guī)模并行測序。
[0017] 樣品CFTR核酸可為任何形式的核酸，包括例如基因組DNA、RNA(如mRNA)或cDNA。
[0018] 在上述方法的一些實(shí)施方案中，對(duì)來自超過一份樣品的CFTR核酸測序。在一些情 況中，并行對(duì)所有樣品同時(shí)測序。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法來擴(kuò)增并測 序來自至少5、10、20、30或35直到40、45、48或50份不同樣品的CFTR核酸。源自單一樣 品的所有擴(kuò)增子可包含指示生成擴(kuò)增子的來源的索引（index)序列，每份樣品的索引不同 于所有其它樣品的索引。因此，索引的使用容許每次測序運(yùn)行合并多份樣品，隨后基于索引 序列確定樣品來源。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，通過在一種設(shè)置中從樣品同時(shí)擴(kuò)增CFTR核酸，使用Access Array?系統(tǒng)（FluidigmCorp.，SanFrancisco,CA)來生成有條形碼的（索引化的）擴(kuò)增子 文庫。然后，可以在測序平臺(tái)，如例如1?〇(*6/454"63?1^ 1￥測序系統(tǒng)0?〇(*6,66?^!^)、 IonTorrent?IonPGM?測序儀（LifeTechnologies,Carlsbad,CA)或MiSeqKf人測序 儀（Illumina,Inc.，SanDiego,CA)上使用生成的文庫。
[0020] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用含有寡核苷酸測序銜接頭的引物擴(kuò)增樣品CFTR 靶區(qū)段以生成銜接頭標(biāo)簽化的擴(kuò)增子。在其它實(shí)施方案中，采用的引物不含銜接頭序列，隨 后將生成的擴(kuò)增子（即在擴(kuò)增后）在擴(kuò)增子的一端或兩端與寡核苷酸測序銜接頭連接。在 一些實(shí)施方案中，所有有義擴(kuò)增子含有相同的測序銜接頭，并且所有反義擴(kuò)增子含有與有 義擴(kuò)增子測序銜接頭的具有不同序列的測序銜接頭。在一些實(shí)施方案中，僅擴(kuò)增和/或測 序單鏈樣品CFTR核酸。
[0021] 可使用本發(fā)明的方法來對(duì)整個(gè)或部分CFTR基因或cDNA測序。在一些實(shí)施方案中， 評(píng)估至少1、2、5、10或20直到25或28個(gè)外顯子。在其它實(shí)施方案中，還評(píng)估整個(gè)或部分 的CFTR啟動(dòng)子區(qū)。還可以評(píng)估一些或所有CFTR內(nèi)含子。在一個(gè)實(shí)施方案中，CFTR靶區(qū)段 在組合時(shí)代表CFTR編碼區(qū)和所有內(nèi)含子/外顯子接合，加上剛好在第一個(gè)外顯子上游（在 5'方向）的約100、500、750、900或1000直到約1000個(gè)核苷酸的0?了1?啟動(dòng)子，加上剛好在 CFTR基因的下游（在3'方向）的約50、100、150或200直到約200、250、300或400個(gè)核苷 酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用至少一種包含表1或表2中顯示的序列的引物，對(duì)一個(gè) 或多個(gè)樣品CFTR核酸測序。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用表1或2中顯示的所有引物。
[0022] 在一個(gè)相似的實(shí)施方案中，代表所有外顯子和一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的部分。
[0023] 還提供了可用作本發(fā)明的方法中的引物的寡核苷酸和寡核苷酸組合。這些寡核苷 酸以基本上純化的材料提供。還提供了試劑盒，其包含用于進(jìn)行擴(kuò)增和測序的寡核苷酸，如 本文中描述