一種基于bodipy的熒光氨基酸及其合成方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)生物工程領(lǐng)域，具體地指一種基于B0DIPY的巧光氨基酸及其合 成方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)作為構(gòu)成生命體系的Ξ大物質(zhì)基礎(chǔ)之一，幾乎參與著生命活動的每一個環(huán) 節(jié)，在生命的誕生、成長和繁衍過程中起著決定性的作用。許多疾病的發(fā)生也與多膚、蛋白 質(zhì)在體內(nèi)發(fā)生變異有著密切的關(guān)系。因此選擇與重大疾病密切相關(guān)的蛋白質(zhì)、多膚W及氨 基酸殘基作為祀標(biāo)，發(fā)展具有高選擇性，高靈敏度的檢測方法，對生命奧秘的掲示，疾病的 早期診斷與藥物的篩選有著重大的意義。
[0003]目前診斷多膚及蛋白質(zhì)的檢測方法主要有免疫標(biāo)記法，同位素標(biāo)記法和巧光檢測 法等。免疫標(biāo)記法很難實(shí)現(xiàn)對活體的檢測，同位素標(biāo)記法具有放射性危害，需要?？诘娜藛T 操作。相對而言，巧光檢測法因其具有靈敏度高、選擇性好，動態(tài)響應(yīng)范圍寬，能在活體內(nèi)檢 測等優(yōu)點(diǎn)在蛋白質(zhì)檢測中得W廣泛應(yīng)用。巧光檢測法根據(jù)祀向蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)設(shè)計(jì)多膚 巧光探針，根據(jù)巧光光譜的變化來檢測目標(biāo)對象，它是痕量蛋白檢測的重要方法。
[0004] 構(gòu)建多膚巧光探針需要考慮兩個方面問題：一，多膚的氨基酸系列和結(jié)構(gòu)； 二，用于標(biāo)記的巧光基團(tuán)。已知的多膚及蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要有β-turn,β-sheet 和α-helix。通過合成β-turn模擬物并將其引入到一個多膚序列中，從而誘導(dǎo) β-sheet結(jié)構(gòu)的形成，運(yùn)類工作已多有報(bào)道[(a)Robinson,J.A.;Thedesi即，synthesis andconformationofsomenewβ-hairpinmimetics:novelreagentsfordrug andvaccinediscovery.Synlett, 1999, 4, 429-441.化）Souers,A.J. ；E1Iman,J. A.β-turnmimeticlibrarysynthesis:scaffoldsandapplications.Tetrahedr on, 2001,57, 7431-7448. ] 〇
[0005] 目前，用巧光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記主要采用兩種方法：一，首先合成多膚，然后在此多膚 上通過化學(xué)方法引入巧光標(biāo)記基團(tuán)。此方法比較繁瑣，需要考慮到巧光基團(tuán)標(biāo)記的位點(diǎn)和 可行性。二，首先合成巧光氨基酸（通過在側(cè)鏈上導(dǎo)入巧光基團(tuán)），然后將其作為一個結(jié)構(gòu) 單元直接用于多膚合成。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，前者是在多膚合成后才考慮導(dǎo)入巧光基團(tuán)， 它可W直接連到某個氨基酸的殘基上，也可W通過搭橋連到多膚的末端，不足之處是巧光 基團(tuán)的引入有時會影響多膚的生物活性，經(jīng)常需要優(yōu)化才能得到理想的標(biāo)記膚，即耗時，又 耗力；第二種方法可W將巧光基團(tuán)靈活且準(zhǔn)確地標(biāo)記在多膚的特殊位點(diǎn)上，因此成為多膚 巧光標(biāo)記領(lǐng)域新的發(fā)展方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是要解決上述【背景技術(shù)】的不足，提供一種具有β-turn模擬物特 性的、基于B0DIPY的巧光氨基酸及其合成方法與應(yīng)用，該氨基酸不僅可W直接用于多膚的 合成，制備巧光標(biāo)記多膚，在結(jié)構(gòu)上還可W誘導(dǎo)該多膚形成穩(wěn)定的β-sheet二級結(jié)構(gòu)。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0008] -種基于B0DIPY的巧光氨基酸，其特征在于，結(jié)構(gòu)通式如下式（I)所示。
[0009]
[0010] 其中，R為-CH3、-H、-F、-Cl、-Br、-I中的一種，
[0011] Ri為-H、-邸3、-邸2邸3、-N03、-F、-C1、-Br、-I中的一種，
[001引尺2為-H、-CH3、-邸2邸3、-N03、-F、-C1、-Br、-I中的一種。
[0013] 優(yōu)選的，具有如下的結(jié)構(gòu)之一。
[0014]
[0015] 本發(fā)明還提供具有上述結(jié)構(gòu)的巧光氨基酸的合成方法，其特征在于，所述合成過 程如下所示。
[0016]
[0017] 其中化合物1為通式（I)中R= -Η、Ri=-Η、R2=-Η時的結(jié)構(gòu)。
[0018] 優(yōu)選的，合成步驟為：
[0019]a.中間體1-1的制備：
[0020] 氮?dú)鈿夥障拢?、苯甲醒、S氣乙酸TFA混合室溫下攬拌l-2h，經(jīng)后處理得到固 體中間體1-1;
[0021] b.中間體1-2的制備：
[0022] 氮?dú)鈿夥障拢?78°C下將溶有氯代下二酷亞胺NCS的四氨巧喃THF溶液加入溶有 中間體1-1的四氨巧喃THF溶液中，保持-78°C攬拌2-化，室溫繼續(xù)攬拌3-地，經(jīng)后處理得 到產(chǎn)物；將得到產(chǎn)物溶于二氯甲燒，加入2, 3-二氯-5, 6-二氯基-1，4-苯釀孤Q，室溫?cái)埌?l-2h，經(jīng)后處理得到固體中間體1-2;
[002引C.中間體1-3的制備：
[0024] 氮?dú)鈿夥障?，中間體Ι-2、Ξ乙胺溶于無水二氯甲燒中，加入Ξ氣化棚乙酸溶液，室 溫?cái)埌?2-1化，經(jīng)后處理得到固體中間體1-3;
[00巧]d.中間體1-4的制備：
[002引中間體1-3、Fmoc保護(hù)的氨基乙硫醇、立乙胺在乙臘中室溫反應(yīng)l-3h，經(jīng)后處理 得到固體中間體1-4;
[0027] e.中間體1-5的制備：
[0028] 中間體1-4、β-丙氨酸叔下醇醋在乙臘中室溫反應(yīng)12-1化，經(jīng)后處理得到固體中 間體1-5 ;
[0029]f中間體1-6的制備：
[0030] 中間體1-5、Fmoc-Osu、^乙胺在二氧六環(huán)中室溫反應(yīng)3-化，經(jīng)后處理得到固體中 間體1-6 ;
[0031] g.化合物1的制備：
[0032] 將中間體1-6溶于二氯甲燒中，冰浴下加入Ξ氣乙酸，室溫反應(yīng)2-地，經(jīng)后處理得 到化合物1 ;
[0033] 上述各步驟中投料比為W下摩爾比：
[0034]a.化咯：苯甲醒：Ξ氣乙酸TFA= 20-25:1:0. 1-0. 2 ;
[0035]b.中間體1-1 :氯代下二酷亞胺NCS:2, 3-二氯-5, 6-二氯基-1，4-苯釀孤Q= 1:2. 2-3:1. 2-2 ；
[0036]C.中間體1-2 乙胺：Ξ氣化棚乙酸=1:2. 2-3:4. 2-5 ;
[0037]d.中間體1-3 :Fmoc保護(hù)的氨基乙硫醇：Ξ乙胺=1:1. 2-2:1. 2-2. 4 ;
[00測 e.中間體1-4 :β-丙氨酸叔下醇醋=1:5-7 ;
[0039]f.中間體 1-5 :Fmoc-〇su乙胺=1:1. 2-2:7. 2-8 ;
[0040]g.中間體 1-6 氣乙酸=1:90-100。
[0041] 本發(fā)明中室溫范圍為：18-30°C [004引優(yōu)選的，步驟為：
[004引a.中間體1-1的制備：
[0044] 氮?dú)鈿夥障?，化咯、苯甲醒、Ξ氣乙酸TFA混合室溫下攬拌1-化，經(jīng)化0H溶液澤滅、 萃取、干燥、過濾、濃縮、重結(jié)晶得到固體中間體1-1 ;
[0045]b.中間體1-2的制備：
[0046] 氮?dú)鈿夥障拢?78°C下將溶有氯代下二酷亞胺NCS的四氨巧喃THF溶液加入溶有中 間體1-1的四氨巧喃THF溶液中，保持-78°C攬拌2-化，室溫繼續(xù)攬拌3-地，經(jīng)加水、二氯甲 燒萃取、干燥、過濾、濃縮得到產(chǎn)物；將得到產(chǎn)物溶于二氯甲燒，加入2, 3-二氯-5, 6-二氯 基-1，4-苯釀DDQ，室溫?cái)埌?-化，經(jīng)水洗、萃取、干燥、過濾、濃縮、硅膠柱層析分離提純得 到固體中間體1-2 ;
[0047]C.中間體1-3的制備：
[0048] 氮?dú)鈿夥障?，中間體Ι-2、Ξ乙胺溶于無水二氯甲燒中，緩慢加入Ξ氣化棚乙酸溶 液，室溫?cái)埌?2-1化，經(jīng)水洗、萃取、干燥、過濾、濃縮、硅膠柱層析分離提純得到固體中間體 1-3。
[0049]d.中間體1-4的制備：
[0050] 將Ξ乙胺加入溶有中間體1-3的乙臘溶液中，再緩慢滴加溶有Fmoc保護(hù)的氨基乙 硫醇的乙臘溶液，室溫反應(yīng)1-化，經(jīng)加水、二氯甲燒萃取、干燥、過濾、濃縮，硅膠柱層析分離 提純得到固體中間體1-4 ;
[0051]e.中間體1-5的制備：
[005引將β-丙氨酸叔下醇醋加入溶有中間體1-4的乙臘溶液中，室溫反應(yīng)12-16h，經(jīng)加 水、二氯甲燒萃取、干燥、過濾、濃縮、硅膠柱層析分離提純得到固體中間體1-5 ;
[005引f.中間體1-6的制備：
[0054] 將Fmoc-Osu、^乙胺加入溶有中間體1-5的二氧六環(huán)溶液中，室溫反應(yīng)3-化，經(jīng)加 稀鹽酸、二氯甲燒萃取、干燥、過濾、濃縮、硅膠柱層析分離提純得到固體中間體1-6 ;
[0055]g.化合物1的制備：
[0056] 將中間體1-6溶于二氯甲燒中，冰浴下加入Ξ氣乙酸，室溫反應(yīng)2-地，經(jīng)加水、二 氯甲燒萃取、干燥、過濾、濃縮、硅膠柱層析分離提純得到固體化合物1。
[0057] 優(yōu)選的，各步驟投料比為W下摩爾比：
[0058]a.化咯：苯甲醒：Ξ氣乙酸TFA= 25:1:0. 1;
[0059]b.中間體1-1 :氯代下二酷亞胺NCS:2, 3-二氯-5, 6-二氯基-1，4-苯釀孤Q= 1:2. 2:1. 2 ；
[0060] C.中間體1-2 乙胺：Ξ氣化棚乙酸=1:2. 2:4. 2;
[006Ud.中間體1-3 :Fmoc保護(hù)的氨基乙硫醇：Ξ乙胺=1:1. 2:1. 2;
[006引e.中間體1-4 :β-丙氨酸叔下醇醋=1:5;
[0063]f.中間體 1-5 :Fmoc-〇su乙胺=1:1. 2:7. 2;
[0064] g.中間體1-6氣乙酸=1:90。
[0065] 本發(fā)明基于B0DIPY的巧光氨基酸在合成多膚中的應(yīng)用。
[0066] 本發(fā)明基于B0DIPY的巧光氨基酸作為巧光探針的在多膚與蛋白質(zhì)互組中的應(yīng) 用。
[0067] 巧光氨基酸結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)包括巧光化合物的選擇和結(jié)構(gòu)改造。本發(fā)明選擇氣棚二化 咯度0DIPY)作為巧光基團(tuán)，原因主要有兩點(diǎn)：一，B0DIPY是性能優(yōu)良的巧光發(fā)色團(tuán)，與其他 巧光團(tuán)相比具有高的巧光量子產(chǎn)率、高的摩爾消光系數(shù)、良好的光穩(wěn)定性、雙光子吸收好， 可用于活體內(nèi)檢測。二，B0DIPY的骨架結(jié)構(gòu)如下所示，C3與Cs之間的距離為5.2Λ，與天然 β-turn中Rw與RW之間的距離相符，所W在3、5連接多膚最有可能形成β-sheet結(jié)構(gòu)。
[0068]
[0069] 根據(jù)上述原因，設(shè)計(jì)了如下式（I)巧光氨基酸的結(jié)構(gòu)：B0DIPY的8位引入苯環(huán)，增 強(qiáng)其穩(wěn)定性，B0DIPY的骨架結(jié)構(gòu)模擬β-turn的i+1和i巧殘基，3, 5位分別用Fmoc保護(hù) 的2-氨基乙琉基和2-簇基乙氨基取代，模擬i和i+3殘基。
[0070]
[0071] 本發(fā)明的有益效果為：將巧光化合物改造成氨基酸類似物，不僅可W直接用于多 膚合成，制備巧光標(biāo)記多膚，同時在結(jié)構(gòu)上它還可W誘導(dǎo)多膚形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，使得到 的巧光多膚具有一定的生物活性，作為探針可W直接用于與蛋白質(zhì)的相互作用研究，具有 重大的實(shí)際應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0072] 圖1為化合物2的二氯甲燒溶液的紅外光譜圖
[0073] 圖2為不同溫度下對化合物2氨基氨的核磁位移值圖
【具體實(shí)施方式】
[0074] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[00巧]本發(fā)明中巧光氨基酸的合成策略是首先合成B0DIPY的骨架結(jié)構(gòu)，3、5位進(jìn)行氯 代，然后分別用Fmoc保護(hù)的2-氨基乙硫醇和-丙氨酸分別在3、5位進(jìn)行親核取代。
[0076] 實(shí)施例1
[0077]a.中間體1-1的制備：
[0078] 取干燥的500ml的兩口瓶，瓶內(nèi)置換成氮?dú)猓尤牖?