一種kpc碳青霉烯酶抑制肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及一種KPC碳青霉締酶抑制膚及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 2013年美國(guó)疾病預(yù)防與控制中屯、宣布優(yōu)先研發(fā)用于治療耐碳青霉締類腸桿菌科 細(xì)菌（Carbapenem-resistantE；nte;robacte;riaceae，CRE)的抗菌藥物。其原因在于產(chǎn)KPC 碳青霉締酶化lebsiellapneumoniaeCarbapenemase，KPC)的CRE菌的出現(xiàn)及擴(kuò)散，嚴(yán)重 降低了β-內(nèi)酷胺類抗菌藥物（包括碳青霉締類抗生素）的臨床療效，使得臨床上治療耐 藥菌感染面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)。CREs往往對(duì)于大多數(shù)抗生素均耐藥，令醫(yī)務(wù)人員頭疼的是運(yùn)一類 耐藥菌有時(shí)僅對(duì)毒性較大的抗菌劑多黏菌素敏感。
[0003] 在CREs中，產(chǎn)KPC-2酶的克雷伯菌屬化lebsiellaSPP.)最為普遍，且在希臘曾出 現(xiàn)過(guò)爆發(fā)性流行（MaltezouΗC,GiakkoupiP,MaragosA,etal.Ou憂reakofinfections duetoKPC-2-producingKlebsiellapneumoniaeinahospitalinCrete(Greece)[J]. JournalofInfection, 2009, 58 (3) : 213-219)。KPC-1 碳青霉締酶于 1996 年在美國(guó)北卡羅 來(lái)納州分離得到的K.peneumoniae中首次被發(fā)現(xiàn)。編碼KPC-2的基因存在于可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的 Τη3家族轉(zhuǎn)座子內(nèi)。到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了十余種KPC酶的亞型，如表1 (紀(jì)明宇，耿大影， 裴鳳艷，等.KPC碳青霉締酶研究概況及進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2013, 31 (4) : 282-285)。 KPC碳青霉締酶不僅能水解包括青霉素類、頭抱菌素類、碳青霉締類、單環(huán)類等所有類型的 0 -內(nèi)酷胺類抗生素，而且同時(shí)能夠滅活克拉維酸、舒己坦、他挫己坦等β-內(nèi)酷胺酶抑制 劑。
[0004] 表1KPC酶種類、發(fā)現(xiàn)時(shí)間和地點(diǎn)
[0005]
[0006]
[0007] 目前臨床上使用的β-內(nèi)酷胺酶抑制劑（克拉維酸、舒己坦、他挫己坦），對(duì)于不 斷出現(xiàn)的新β-內(nèi)酷胺酶的抑制效果越來(lái)越不明顯，因此迫切需要一種可W用于治療因產(chǎn) KPC碳青霉締酶而耐藥的病原菌引起的細(xì)菌感染的KPC碳青霉締酶抑制劑。臨床分離獲得 的產(chǎn)碳青霉締酶的耐藥菌株中，W產(chǎn)KPC-2酶的多藥耐藥菌株最為常見(jiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種KPC碳青霉締酶抑 制膚。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述KPC碳青霉締酶抑制膚的應(yīng)用。將本發(fā)明的KPC 碳青霉締酶抑制膚與β內(nèi)酷胺類抗生素合用，可顯著提高β內(nèi)酷胺類抗生素的抗菌活性。
[0010] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] 一種KPC碳青霉締酶抑制膚，為4個(gè)氨基酸組成的線性小膚，其氨基酸序列為 Pro-Asn-Gln-T巧，理論分子量591. 58,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。
[001引上述KPC碳青霉締酶抑制膚可通過(guò)固相合成法制備，方法簡(jiǎn)單，技術(shù)成熟、產(chǎn)物質(zhì) 量容易控制，能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0013] 上述KPC碳青霉締酶抑制膚在抑制KPC碳青霉締酶中的應(yīng)用。
[0014] 上述KPC碳青霉締酶抑制膚在制備預(yù)防和/或治療耐藥菌感染相關(guān)疾病的藥物和 /或抗菌藥物中的應(yīng)用。所述的耐藥菌為因產(chǎn)KPC碳青霉締酶而獲得耐藥性的細(xì)菌，所述的 抗菌為抗因產(chǎn)KPC碳青霉締酶而獲得耐藥性的細(xì)菌。
[0015] 一種抗菌藥物組合物，包含所述的KPC碳青霉締酶抑制膚，還包含該抑制膚藥學(xué) 上可接受的鹽和/或藥學(xué)上可接受的載體。
[0016] 所述的KPC碳青霉締酶抑制膚與β-內(nèi)酷胺類抗生素具有良好的協(xié)同作用，能明 顯抑制耐藥菌生長(zhǎng)并且大幅度降低β-內(nèi)酷胺類抗生素的最小抑菌濃度（MIC)。該抑制膚 通過(guò)抑制KPC碳青霉締酶活性從而保護(hù)β-內(nèi)酷胺類抗生素的藥效結(jié)構(gòu)一-β內(nèi)酷胺環(huán) 免于被該類酶水解從而發(fā)揮抗生素的抗菌活性。
[0017] 一種抗菌藥物組合物，包含所述的KPC碳青霉締酶抑制膚和β-內(nèi)酷胺類抗生素， 還包含該抑制膚和β-內(nèi)酷胺類抗生素藥學(xué)上可接受的鹽和/或藥學(xué)上可接受的載體。將 本發(fā)明的抑制膚與β內(nèi)酷胺類抗生素合用能更有效的抑制耐藥菌的生長(zhǎng)。
[0018] 所述的β-內(nèi)酷胺類抗生素優(yōu)選為氨節(jié)西林、阿莫西林、贓拉西林、替卡西林、氣 氧頭抱、頭抱替挫、頭抱嚷朽、頭抱曲松鋼、頭抱他晚、頭抱化朽、頭抱洛林、亞胺培南、美羅 培南、比阿培南、多尼培南、厄他培南、氨曲南中的一種或多種。更優(yōu)選的，所述的β-內(nèi)酷 胺類抗生素為美羅培南。
[0019] 通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)表明，所述的KPC碳青霉締酶抑制膚在濃度高達(dá)7. 5mg/mL時(shí)未發(fā)生 明顯的溶血反應(yīng)，其安全性高。
[0020] 上述抗菌藥物組合物可W根據(jù)藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)制劑方法制備成注射劑、片劑、注 射用無(wú)菌粉末、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、口服液、膏劑、霜?jiǎng)┑榷喾N劑型。該抗菌藥物組合物可 W通過(guò)注射、口服、滴鼻、滴眼、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法導(dǎo)入肌肉、內(nèi)皮、皮下、靜脈或粘膜組 織，或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入肌體。
[0021] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)與效果：本發(fā)明的KPC碳青霉締酶抑制膚具有良好的KPC碳 青霉締酶抑制活性，且安全性高；其人工合成方便，生產(chǎn)成本低，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)； 將該抑制膚與β-內(nèi)酷胺類抗生素聯(lián)合使用可避免抗生素被酶水解破壞而失效，在治療耐 藥菌感染領(lǐng)域具有良好的開(kāi)發(fā)前景；本發(fā)明的KPC碳青霉締酶抑制膚為開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物 及復(fù)方制劑提供了新的選擇。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1是KPC碳青霉締酶抑制膚Pro-Asn-Gln-T巧的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖。
[0023] 圖2是制備的KPC碳青霉締酶抑制膚Pro-Asn-Gln-T巧的質(zhì)譜結(jié)果圖。
[0024] 圖3是KPC碳青霉締酶抑制膚Pro-Asn-Gln-T巧對(duì)KPC-2碳青霉締酶抑制活性的 測(cè)定結(jié)果圖；圖中，KPC-2酶：KPC-2碳青霉締酶，抑制膚：KPC碳青霉締酶抑制膚。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。其 中
[0026] 下屬實(shí)施例中表達(dá)KPC-2碳青霉締酶的工程菌E.coliRosetta(DE3) / 祀T28a-KPC-2的構(gòu)建及該酶的表達(dá)純化方法如下：
[0027] 根據(jù)GenBank中編碼KPC-2碳青霉締酶的基因化laiipc2基因）全序列（GenBank ID:KJ151293. 1)，用PrimerPremier5設(shè)計(jì)PCR引物，上下游引物序列分別為：KPC-2-F:5' -CGCGGATCCATGTCACTGTATCGCC-3' (下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)）；KPC-2-R:5'-CCAAGC 111'174押601^1764〔6(：-3'（下劃線部分為化11(1111酶切位點(diǎn)）。61曰陽(yáng)。2〇臟模板由上海捷瑞 生物工程有限公司合成。
[002引通過(guò)PCR擴(kuò)增blawc2基因，PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min;94°C變性0. 5min， 54°C退火1. 5min，72°C延伸1. 5min，共30個(gè)循環(huán)；72°C再延伸lOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳 鑒定后測(cè)序。
[0029] 將經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及祀T28a空質(zhì)粒分別經(jīng)BamHI和化ndIII雙酶切，用核酸凝膠 回收試劑盒回收blawc2基因片段和質(zhì)粒片段。用T4DNALigase將blawc2基因與祀T28a 質(zhì)粒片段于16°C連接12h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。
[0030] 挑取測(cè)序正確的陽(yáng)性單克隆菌株E.coliRosetta(DE3)/pET28a-KPC-2,接種于新 配的滅菌LB液體培養(yǎng)基中（含 50mg/mLKanamycin)，WE.coliRosetta(DE3)/pET28a作 為陰性對(duì)照，37°C、200r/min培養(yǎng)至ODe。。為0. 6~0. 8,加入終濃度為0. 2mmol/LIPTG誘 導(dǎo)表達(dá)，28°C繼續(xù)培養(yǎng)化。取1血菌液于EP管中，80(K)r/min離屯、2min，棄去上清，收集菌 體沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)。
[0031]將500血誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于4°C、lOOOOr/min冷凍離屯、20min，棄去培養(yǎng)基，收集菌 體，W每克濕菌加入10血緩沖液（30mmol/L胞&?〇4,lOOmmol/L化C1，pH7.W的比例重懸 菌體。冰浴超聲將菌體破壞后于4°C、lOOOOr/min離屯、20min，棄去破碎的菌體沉淀，保留上 清液。將5血上清液加入Ni2+-NTA層析柱中，先加入25血洗涂緩沖液（30mmol/LTris-肥1， lOOmmol/LNaCl，30mmol/L咪挫，pH7. 5)，然后加入 10血洗脫緩沖液（30mmol/LTris-HCl， lOOmmol/LNaCl，lOOmmol/L咪挫，pH7. 5)獲得KPC-2 重組蛋白（KPC-2 碳青霉締酶）。
[0032] 實(shí)施例1 KPC碳青霉締酶抑制膚的制備
[0033]KPC碳青霉締酶抑制膚的氨基酸序列為Pro-Asn-Gln-Trp，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所 /J、- 〇
[0034]W9-巧甲氧幾基（FM0C)為N端保護(hù)基團(tuán)，采用固相合成法合成KPC碳青霉締酶 抑制膚。用92%Ξ氣乙酸、5%水和3%Ξ異丙甲硅烷Ο?Α)的混合液（92%、5%、3%均為 質(zhì)量百分比）將其從ΜΒΗΑ樹脂上裂解。乙酸多次沉淀后，經(jīng)制備型反相高效液相色譜法 (RP-冊(cè)LC)純化。使用C18反相制備柱（20mmX250mm，5ym);流動(dòng)相：0. 06%Ξ氣乙酸， 0% -80%化06%、0% -80%為體積百分比）乙臘為流動(dòng)相，1. 5血/min的流速進(jìn)行梯度洗 脫。經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)，其純度>98%，凍干備用。經(jīng)ESI-QT0F-MS鑒定，其分子量與相應(yīng)膚的 理論分子量一致，m/巧92. 71 [M+田+，質(zhì)譜結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0035] 實(shí)施例2 KPC碳青霉締酶抑制膚對(duì)KPC-2碳青霉締酶抑制活性的測(cè)定
[0036] W美羅培南為報(bào)告底物，實(shí)驗(yàn)分為3組，保持溫度為37 ±rC:
[0037] (1)美羅培南+KPC-2碳青霉締酶組：向5μL濃度為2mmol/L的美羅培南與90μL 濃度為30mmol/L的肥陽(yáng)S緩沖液（ρΗ7. 4)的混合溶液中加入5μL濃度為1ymol/L的 KPC-2碳青霉締酶，總體積為100μL。
[0038] (2)美羅培南+KPC-2碳青霉締酶+酶抑制膚組：向5μL濃度為2mmol/L的美羅 培南與80μL濃度為30mmol/L的肥PES緩沖液（pH7. 4)的混合溶液中加入5μL濃度為 1μmol/L的KPC-2碳青霉締酶與10μL濃度為1μmol/L的KPC碳青霉締酶抑制膚，總體積 為 100μL。
[0039] (3)美羅培南組：向5μL濃度為2mmol/L的美羅培南中加入95μL濃度為30mmol/ L的肥陽(yáng)S緩沖液（pH7. 4)，總體積為100μL。
[0040] 由于報(bào)告底物美羅培南被酶水解后其吸光度下降，因而通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)為300nm的 吸光度的變化可W反應(yīng)出底物的水解程度。結(jié)果如圖3所示：（1)組吸光度在500秒內(nèi)下 降最快，說(shuō)明KPC-2碳青霉締酶能高效地催化底物美羅培南的水解；(2)組吸光度雖然也有 一定程度的降低，但相對(duì)于（1)