一種提高植物耐鹽耐旱性的蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，具體設及一種提高植物耐鹽耐旱性的蛋白及其編碼基 因與應用。
【背景技術】
[0002] 非生物逆境，如高溫、干旱、高鹽、堿性±壤、重金屬W及過氧化逆境等，都嚴重威 脅著農業(yè)生產，是造成世界范圍內農作物減產的主要原因。植物的生長、發(fā)育W及農作物的 產量、品質和后期生長等均受到非生物逆境脅迫的影響，而且全球范圍內的主要作物60% 的減產量是由非生物逆境的脅迫所導致。為了確保農作物持續(xù)穩(wěn)定的高產，人類亟需培育 出對干旱、高鹽、過氧化等非生物逆境脅迫具有更高耐受能力的作物新品種。但通過傳統的 育種方法在改善農作物的性狀和抗逆性的進展緩慢，而利用生物基因工程技術則具有良好 的預見性、更高的效率，是培育具有耐逆性農作物新品種最有效的途徑。利用現代分子生物 學技術發(fā)現新的耐逆境基因，是培育抗逆性農作物新品種的關鍵所在。
[0003] 干旱和高鹽脅迫是限制谷類作物產量增加最主要的兩個因素。為了適應運些不利 環(huán)境帶來的生存壓力，植物進化出了多種多樣的復雜的生物機制，調節(jié)許多逆境相關基因 的表達，試圖減少運些逆境對其造成的損傷。運些基因參與到不同的生物途徑和過程中，包 括逆境感知和信號轉導，從而導致分子、生化、細胞、生理和形態(tài)的適應，最終使整個植物發(fā) 生響應。到目前為止，已經有大量的逆境相關基因被克隆和鑒定，例如水稻Pro合成酶基因 (0sP5CS;)、水稻Pro轉運酶基因（OsProT)、水稻轉錄因子基因（0SDREB2A)和水稻胚胎晚 期豐富蛋白基因（0SLEA3)。運些基因一旦被激活，則會影響MDA和Pro在細胞中的積累，從 而使植物免受由于高鹽、干旱和過氧化物等逆境脅迫所產生的傷害。MDA是反應脂質過氧 化損傷程度最重要的指標。自由Pro的積累則是植物在遭受非生物逆境時最重要的反應機 審IJ，其作用在于通過改變細胞內的滲透勢來維持植物的亞細胞結構，從而使植物免受逆境 的傷害。
[0004] 研究顯示，大量的PMP3家族基因參與植物對逆境的反應過程。PMP3是一類廣泛 存在于在包括酵母、小型動物、水草和高等植物在內的多種生物體內的疏水性小蛋白，且W 多基因家族的形式存在。大量實驗結果表明，植物PMP3基因對包括高鹽、干旱或者寒冷 等在內的多種逆境有所反應，從而參與植物對逆境脅迫的響應過程。運些基因編碼的蛋 白質包括來自大麥的LeESUiXophopyrumelongatum)、來自水稻的 0sRCI2-5、0sLti6a/ b和RIGIB(Oryzasativa)、來自羊草的AcPMP3_l(Aneurolepidiumchinense)、來自水稻 的AtRCI2A/B/D/F(A;r油idopsisthaliana)、來自星星草的PutPMP3-l/-2(Puccinellia tenuiflora)和來自玉米的ZmPMP3-2/3/4狂eamays)。有證據顯示，PMP3基因的功能和反 應根據其參與的不同的逆境反應途徑而各有不同。例如蛋白質AtRCI2A可能參與水稻在非 生物逆境下不依賴CBF/DREB1信號途徑的反應過程，但是水稻中的0sLti6a蛋白則在低溫 逆境條件下受DR邸轉錄因子的調節(jié)。報道顯示，植物PMP3基因也能被一些信號分子所誘 導表達，運些信號包括：ΑΒΑ和&〇2,因此我們推測PMP3基因可能在植物ΑΒΑ依賴型逆境反 應過程中也發(fā)揮著重要的作用。
[0005] 在酵母中，Pmp化蛋白能夠阻止外界環(huán)境中的化+離子進入到細胞中，從而起到保 護細胞膜的電位的作用。將植物的PMP3蛋白在酵母中異源表達后，能夠彌補pmp3突變體 所缺失的功能，說明植物中的PMP3蛋白可能也具有類似的作用。敲除水稻的AtRCI2A基 因后，突變體植株對鹽和化+離子的敏感性增強而在水稻中過量表達AtRCI2A基因則具有 相反的作用。而且，在羊草中，ACPMP3-1基因被定位在具有調節(jié)化+和K+離子濃度的根冠 中。雖然人們普遍認為PMP3基因間接參與調控了細胞對離子的吸收，但是其確切的作用機 制仍然有待闡明。由于PMP3蛋白的分子質量普遍較小，它們是不可能形成離子通道的，因 此人們對PMP3蛋白在逆境反應過程中的具體作用仍知之甚少。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明旨在克服現有技術的不足，提供一種提高植物耐鹽耐旱性的蛋白及其編碼 基因與應用。
[0007] 所述提高植物耐鹽耐旱性的蛋白的序列如SEQIDNO. 1所示，命名為MePMP3-2蛋 白，來源于木署。
[0008] 編碼上述蛋白的基因的序列如SEQIDNO. 2所示，命名為MePMP3-2基因。
[0009] 所述植物重組表達載體含有上述的MePMP3-2基因。
[0010] 優(yōu)選地，所述植物重組表達載體是將所述的MePMP3-2基因插入空載體中而構建 的植物重組表達載體，所述空載體選自抑B、PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、PBI121、pBinl9、 PCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或地Y505。
[0011] 優(yōu)選地，所述植物重組表達載體是將所述的MePMP3-2基因插入到空載體P皿的多 克隆位點而構建的植物重組表達載體，植物重組表達載體的序列如SEQIDNO. 3所示，命名 為P皿：：MePMP3-2植物表達載體。
[0012] 上述蛋白MePMP3-2、上述MePMP3-2基因和上述植物重組表達載體可用于培育耐 旱和耐鹽植物。所述植物為為雙子葉植物或單子葉植物。所述單子葉植物為水稻。
[0013] 下面對本發(fā)明作進一步說明：
[0014] MePMP3-2的氨基酸序列（SEQIDNO. 1)，包括77個氨基酸，該蛋白質的分子 量為8. 65KD，等電點為4. 94。生物信息學分析結果發(fā)現，MePMP3-2含有保守結構域 PS01309 ([LIVF] -X- [STAC] - [LIVF] (3) -P- [PF] - [LIVA] - [GAV] - [IV]-X(4) - [GK閑），分別是 SEQIDNO. 1中的第11-27位W及第33-50位的氨基酸組成的結構域。該蛋白質是國際上 未曾報道的新蛋白質。
[0015] SEQIDNO. 2所述序列為編碼MePMP3-2的全長cDNA序列，該序列共由743個堿基 組成，其中，5'端未翻譯區(qū)包括180個堿基，3'端未翻譯區(qū)包括200個堿基（其中包括第271 位-第399位堿基組成的內含子，不參與該蛋白質的編碼），編碼區(qū)由231個堿基（第181 位-第270位和第400-第543位）組成，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的MePMP3-2 蛋白，編碼區(qū)中，A占15. 15% (35個），C占25. 54%巧9個），G占21. 21% (49個），T占 38. 09 % (88個），A巧占53. 25 % (123個），C+G占46. 75 % (108個）。數據庫捜索氨基酸 與核巧酸序列發(fā)現，PMP3基因家族是目前已知基因中與MePMP3-2同源性最高的基因，雖然 核巧酸序列的同源性較低，但是氨基酸的同源性達到53. 8%，初步推測基因MePMP3-2屬于 PMP3基因家族。目前為止，尚未發(fā)現任何與該基因的相關的研究報道。
[0016] 可用現有的植物表達載體構建含有MePMP3-2基因的重組表達載體。所述植物 表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如P皿、PCAMBIA3301、 PCAMBIA1300、PBI121、地inl9、PCAMBIA2301、PCAMBIA1301-UMN、地Y505 或其它衍生植物 表達載體。
[0017] 使用MePMP3-2基因構建重組表達載體時，可在其轉錄起始核巧酸前加上任何一 種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花挪菜花葉病毒（CAMV)35S啟動子、泛 素OJbiquitin)基因啟動子（P化i)、Actin啟動子等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動 子結合使用。
[0018] 此外，使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子 或轉錄增強子，運些增強子區(qū)域可W是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需 與編碼序列的閱讀框相同，W保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子 的來源是廣泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻譯起始區(qū)域可W來自轉錄起始區(qū)域或 結構基因。
[0019] 為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入在植物中表達可產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、 蛋光素酶基因等）、具有抗性的抗生素標記物（慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等）或是 抗化學試劑標記基因（如抗除莽劑基因）等。
[0020] 上述植物重組表達載體是將上述的MePMP3-2基因插入P皿的多克隆位點，得到的 植物重組表達載體。
[0021] 將上述的MePMP3-2基因導入目的植物，得到耐旱和耐鹽轉基因植物，所述耐旱和 耐鹽轉基因植物的耐旱和耐鹽性高于目的植物。
[0022] 所述耐旱和耐鹽轉基因植物為耐高鹽、耐甘露醇、耐PEG和/或耐干旱轉基因植 物。
[0023] 上述的MePMP3-2基因是通過上述的植物重組表達載體導入目的植物中