一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶根霉及其發(fā)酵產(chǎn)酶方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種甸枝根霉及其篩選方法、甸枝根霉作為 生產(chǎn)β-葡萄糖巧酶的應(yīng)用、β-葡萄糖巧酶的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維素酶是由Ξ種不同的酶組成的多酶復(fù)合物：外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和 0-葡萄糖巧酶度化)，Ξ種酶協(xié)同作用完成對(duì)纖維素的水解。目前使用的纖維素酶生產(chǎn)菌 株由于β-葡萄糖巧酶活力相對(duì)較低，大幅度限制了纖維素酶對(duì)纖維質(zhì)的總體水解速率， 使得β-葡萄糖巧酶作為纖維素酶水解纖維素過程的限速酶而成為酶解木質(zhì)纖維素生產(chǎn) 燃料乙醇的技術(shù)瓶頸。 陽00引 β -葡萄糖巧酶巧C 3. 2. 1. 21，BGL)，又稱β -D-l，4-葡萄糖巧水解酶，常與內(nèi)切 葡聚糖酶巧C 3. 2. 1. 4, EG)和纖維二糖水解酶巧C 3. 2. 19LCBHS)共同構(gòu)成一組可對(duì)纖維 素進(jìn)行高效協(xié)同作用的纖維素酶系。β-葡萄糖巧酶可將纖維二糖徹底水解并釋放葡萄糖， 同時(shí)該酶常因微生物自然分泌量的不足而成為整個(gè)纖維素酶系水解過程中的主要限速酶。 β-葡萄糖巧酶對(duì)纖維二糖的水解活性最強(qiáng)，但由于β-葡萄糖巧酶對(duì)底物（糖基）部分結(jié) 構(gòu)的專一性較差，使得β-葡萄糖巧酶不僅能夠使C-0、C-S、C-N和C-F等鍵斷裂，還可W 水解β-半乳糖巧鍵，甚至由于對(duì)糖分子結(jié)構(gòu)中Q位的專一性不高而能夠水解木糖，運(yùn)使 得β-葡萄糖巧酶除了可W與其它纖維素酶組分協(xié)同水解纖維素外，還可W單獨(dú)在糖巧轉(zhuǎn) 移或水解、制茶W及食品增香等多個(gè)領(lǐng)域使用。
[0004] β-葡萄糖巧酶廣泛分布于細(xì)菌、霉菌、酵母、植物和動(dòng)物等物種中，其中小型絲狀 真菌由于產(chǎn)量高、酶系豐富、易于廉價(jià)培養(yǎng)和發(fā)酵控制等特點(diǎn)，被認(rèn)為是β-葡萄糖巧酶良 好的生產(chǎn)菌株。目前關(guān)于β-葡萄糖巧酶生產(chǎn)和研究的絲狀真菌主要有木霉屬、曲霉屬和 青霉屬微生物，但是它們的發(fā)酵周期一般在6dW上，具有耗時(shí)長、效率低等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)W上不足，本發(fā)明提供了一種甸枝根霉及其篩選方法、甸枝根霉作為生產(chǎn) β-葡萄糖巧酶的應(yīng)用、β-葡萄糖巧酶的生產(chǎn)方法，該甸枝根霉菌株可W豆巧、硫酸錠、尿 素、氯化錠為氮源，W教皮汁、乳糖、淀粉糖、稻草賴桿、玉米賴桿等為碳源經(jīng)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn) 0 -葡萄糖巧酶，所生產(chǎn)的β-葡萄糖巧酶可W被應(yīng)用于生物質(zhì)能源、紡織和食品等方面。
[0006] 甸枝根霉（Miizopusstolonifer)ΤΡ-02,保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 11119。保藏單 位為中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏日期為2015年7月16日，保藏 地址為：中國科學(xué)院微生物研究所，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
[0007] 所述甸枝根霉煙lizopusstolonife;r)TP-02是從黃山腐木中篩選得到的。該菌 株在±豆培養(yǎng)基平板上生長速度快，生長初期菌絲為白色，培養(yǎng)后期產(chǎn)生大量黑褐色分生 抱子。
[0008] 本發(fā)明還提供了甸枝根霉的菌種篩選方法，包括W下步驟：培養(yǎng)基平板初篩、搖瓶 復(fù)篩、發(fā)酵培養(yǎng)、菌種鑒定。
[0009] 所述培養(yǎng)基平板初篩所用培養(yǎng)基平板的配方為：每L培養(yǎng)基含有：±豆浸出汁 20邑，葡萄糖20g，卡那霉素lOOmg，瓊脂粉20g;
[0010] 所述搖瓶復(fù)篩所用種子培養(yǎng)基的配方為：每L培養(yǎng)基含有：±豆浸出汁200g，乳糖 lOg;
[0011] 所述發(fā)酵培養(yǎng)所用發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每L培養(yǎng)基含有：稻草賴桿10g，5%教皮 浸出汁lOOg，（NH4)2S〇43g，皿2?〇4山MgS〇4·π?2〇Ig，CaC!22g，失水山梨醇單油酸醋聚氧乙 締酸 0. 025g。
[0012] 本發(fā)明還提供了甸枝根霉作為生產(chǎn)β-葡萄糖巧酶的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種β-葡萄糖巧酶的生產(chǎn)方法。該方法具有發(fā)酵周期短、耗時(shí) 短、效率高的特點(diǎn)。
[0014] 其技術(shù)方案為：一種β-葡萄糖巧酶的生產(chǎn)方法，包括W下步驟：
[0015] (a)制備種子培養(yǎng)液，將權(quán)利要求1所述的甸枝根霉在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進(jìn)行 接種；
[0016] 化）使用產(chǎn)β-葡萄糖巧酶培養(yǎng)基液態(tài)發(fā)酵β-葡萄糖巧酶。
[0017] (C)使用ΑΚΤΛprimeplus純化系統(tǒng)對(duì)β-葡萄糖巧酶進(jìn)行純化
[0018] 所述步驟（a)具體包括：菌種在斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d后用無菌水洗下抱子，使用 血球計(jì)數(shù)板計(jì)算抱子數(shù)并稀釋至1X105個(gè)/mL。按1%體積接種量接入種子培養(yǎng)基中，于 30°C、200rpm條件下培養(yǎng)24h后作為種子液備用，使用-80°C超低溫甘油凍結(jié)管保藏法保藏 種子液。
[0019] 取-80°c超低溫甘油凍結(jié)管置25-32Γ室溫溶解，并劃線接種于斜面培養(yǎng)基，于 30°C培養(yǎng)培養(yǎng)3d后用無菌水洗下菌絲或抱子，每個(gè)平板使用5mL無菌水進(jìn)行洗涂，將洗涂 后獲得的菌絲懸液接入種子培養(yǎng)基中，洗涂后獲得的菌絲懸液與種子培養(yǎng)基的體積比為 1:24, 30°C、200巧m/min恒溫培養(yǎng)24h后，即可得到種子培養(yǎng)液。
[0020] 所述斜面培養(yǎng)基配方：每L培養(yǎng)基含有：±豆浸出汁200g，葡萄糖20g，瓊脂20邑。
[0021] 所述種子培養(yǎng)基配方：每L培養(yǎng)基含有：±豆浸出汁200g，葡萄糖20g，瓊脂20邑， pH6. 0〇
[0022] 所述步驟化）具體包括：
[0023] 將步驟（a)得到的種子培養(yǎng)液接種到產(chǎn)β-葡萄糖巧酶培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)液與 產(chǎn)0 -葡萄糖巧酶培養(yǎng)基的體積比為1:9~14,30°C、200~350巧m/min、PH5. 5~6. 0的 培養(yǎng)條件下培養(yǎng)88h。 W24] 所述產(chǎn)β-葡萄糖巧酶培養(yǎng)基的配方為：每L培養(yǎng)基含有：80~120目5~ 15邑的玉米賴桿、稻草、或麥桿，5%教皮浸出汁80~120邑，（畑4)25〇425~30邑，皿2口〇41〇邑， Μ拆〇4· 7&0 5~lOg，CaClzlO~20g，失水山梨醇單油酸醋聚氧乙締酸0. 1~0. 25邑， FeS〇4 · 7&0 0. 005g，MnS〇4 · &0 0. 00156g，ZnS〇4 · 7&0 0. 0014g，C0CI2O. 〇〇2邑。 陽0巧]所述5%教皮浸出汁的制備方法為：50g教皮，煮沸30分鐘，4層紗布過濾，定容至 1000血。
[00%] 所述步驟（C)具體包括：
[0027] 發(fā)酵8化后結(jié)束發(fā)酵，并使用4層紗布過濾去除發(fā)酵液中的菌絲體等大型固體物， 過濾液在4°C、500化/min條件下離屯、30min，收集上清液，即制得β-葡萄糖巧酶粗酶液。 粗酶液經(jīng)70 %飽和硫酸錠鹽析后使用超純水溶解沉淀并經(jīng)透析過夜后于4°C、lOOOOr/min 高速離屯、lOmin，取上清并使用0. 22μm微孔濾膜過濾。
[0028] 使用沿cm prime plus純化系統(tǒng)對(duì)濾過液進(jìn)行純化。粗酶液上樣于Se地adex G-100柱子，洗脫液為pH4. 8的醋酸-醋酸鋼緩沖液，洗脫梯度為15ml A ;收集含β -葡萄糖 巧酶的洗脫峰經(jīng)化trapTMdesalting (GE)柱脫鹽并真空冷凍干燥；使用抑7. 0的化is-肥1 緩沖液溶解酶粉并上樣于Hitrap? DEAE-Se地arose FF(GE)柱，使用20mmol/L Tris-肥1 緩沖液（0. 1~1. Omol/L化Cl，pH 7. 0)進(jìn)行梯度洗脫；收集含β -葡萄糖巧酶的洗脫峰再 經(jīng)化trap? desalting (G巧柱脫鹽并真空冷凍干燥，使用抑4.0的醋酸-醋酸鋼緩沖液溶 解酶粉并上樣于化trapTMCM-Se地arose F(GE)柱，收集含β-葡萄糖巧酶的洗脫峰并進(jìn)行 酶活力測(cè)定和SDS-PAGE(聚丙締酷胺凝膠電泳）測(cè)定。對(duì)純化酶液進(jìn)行再脫鹽和真空冷凍 干燥W制備β-葡萄糖巧酶酶粉備用。
[0029] 該β-葡萄糖巧酶活力的檢測(cè)方法為：
[0030] 采用水楊巧法測(cè)定：準(zhǔn)確吸取酶液0. 5mU加入ImL1 %水楊巧（w/v)及0. 5mLpH 4. 8的0. 05mol/L巧樣酸一巧樣酸鋼緩沖溶液，于50°C保溫30min后加入3血DNS試劑，沸 水浴加熱lOmin，冷卻后加水稀釋至25mU測(cè)定520nm處吸光值。
[0031] 所述酶液的制備方法為：將純化后獲得的β-葡萄糖巧酶酶粉用抑4. 8的 0. 05mol/L巧樣酸一巧樣酸鋼緩沖溶液稀釋成0. 1~lU/mL的酶液。 陽03引所述1%水楊巧的制備方法為：將Ig水楊巧溶于100血抑4. 8的0. 05mol/L巧 樣酸一巧樣酸鋼緩沖溶液而制得。
[0033] β-葡萄糖巧酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘水解生成1μmol葡萄 糖所需的酶量為1個(gè)酶活國際單位（IU)。
[0034] 本發(fā)明中提供的菌種及液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖巧酶方法與其它菌種和液態(tài)發(fā)酵 制備β-葡萄糖巧酶方法相比較具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0035] 1.菌種生長速度快，產(chǎn)酶速率高，發(fā)酵時(shí)間短，在4d內(nèi)可結(jié)束發(fā)酵。
[0036] 2.菌種為野生菌，活力旺盛，不易染菌，易于純培養(yǎng)。
[0037] 3.菌種可利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物如教皮汁、稻草賴桿、麥賴桿、玉米賴桿發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄 糖巧酶，營養(yǎng)基質(zhì)利用范圍廣且成分廉價(jià)、易得。
[00測(cè) 4.重復(fù)發(fā)酵性能穩(wěn)定，發(fā)酵活力達(dá)16IU/血W上。
[0039] 5.發(fā)酵抑適應(yīng)范圍廣，工藝控制簡單。 W40] 6.酶液在60°CW下熱穩(wěn)定性良好，在抑4. 0~7. 0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。
【附圖說明】
[0041] 圖1甸枝根霉菌株TP-02菌落照片（左）和抱子電鏡照片（右）；
[0042] 圖2甸枝根霉菌株TP-02系統(tǒng)進(jìn)化樹；
[0043]圖3甸枝根霉菌株TP-02發(fā)酵產(chǎn)β -葡萄糖巧酶曲線；
[0044] 圖4 β -葡萄糖巧酶分離純化SDS-PAGE圖，Μ :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；4-7 :純化后 β-葡萄糖巧酶樣品；