一種高效表達(dá)羅氏沼蝦模式識(shí)別蛋白lgbp的釀酒酵母工程菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種高效表達(dá)羅氏沼郵模式識(shí)別蛋白LGBP的釀酒酵母工程菌，屬于 生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是我國(guó)經(jīng)濟(jì)出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)業(yè)之一，漁業(yè)在我國(guó)已成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的 增長(zhǎng)點(diǎn)。近年來(lái)甲殼類動(dòng)物病害日趨嚴(yán)重，給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]甲殼類動(dòng)物缺乏后天獲得的特異性免疫功能，但是它們有比較完善的先天性非 特異性免疫系統(tǒng)，能夠迅速識(shí)別和有效清除入侵的微生物。甲殼類動(dòng)物的非特異性免疫 機(jī)制包括甲殼和粘液的屏障作用、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞隧作用W及非特異性體液分子。（1) 模式識(shí)風(fēng)I蛋白(Patternrecognitionproteins,PRPs)，包括LGBP(lipopolysaccharide andβ-1, 3-glucan-bindingprotein,LGBP)與抗月旨多糖因子（Anti-Lipopolysaccharide factor,ALF)等，它們能與外來(lái)病原表面的脂多糖β-1,3-葡聚糖和膚聚糖等結(jié)合并等識(shí) 別病原體相關(guān)的分子模式（pathogen-associatedmolecularpatte;rns，PAMPs)，繼而激活 酪氧化酶原（pro-phenoloxidase，proPO)系統(tǒng)；（2)酪氧化酶激活系統(tǒng)。甲殼動(dòng)物酪氧化 酶酶原在血細(xì)胞中合成后釋放到血漿中。酪氧化酶酶原通過(guò)酪氧化酶酶原激活酶的水解轉(zhuǎn) 化成有活性的酪氧化酶，催化單酪化合物氧化成鄰二酪產(chǎn)物（o-diphenols)，再氧化成鄰二 釀（o-quinones)，鄰二釀抑制病原體胞外蛋白酶和幾下質(zhì)酶的活性，從而抑制甚至殺死病 原體。
[0004] 目前，還未見(jiàn)有羅氏沼郵LGBP基因的蛋白真核表達(dá)及蛋白功能研究的報(bào)道。眾所 周知，基因的異源表達(dá)受到宿主、載體、啟動(dòng)元件等多種因素的影響。因此，如何實(shí)現(xiàn)模式識(shí) 別蛋白LGBP的異源表達(dá)、活性表達(dá)、高效表達(dá)是目前亟需解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明利用釀酒酵母實(shí)現(xiàn)了羅氏沼郵（Macrobrachium rosenbergii)模式識(shí)另。蛋白LGBP(lipopolysaccharideandβ-1, 3-glucan-binding protein)的異源表達(dá)、活性表達(dá)、高效表達(dá)，對(duì)增強(qiáng)甲殼類動(dòng)物對(duì)各種主要疾病和環(huán)境變化 的抵抗力、有效促進(jìn)其健康生發(fā)揮了重要作用。
[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種高效表達(dá)羅氏沼郵模式識(shí)別蛋白LGBP的釀酒酵 母工程菌，所述工程菌的構(gòu)建方法是將羅氏沼郵模式識(shí)別蛋白LGBP的cDNA克隆至表達(dá)質(zhì) 粒PHAC181上得到測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒PHAC181-LGBP，然后設(shè)計(jì)同源重組引物，利用 同源重組技術(shù)將目的基因LGBP整合至釀酒酵母宿主菌株的GAL1啟動(dòng)子下游。該工程菌在 半乳糖的誘導(dǎo)下，可高效表達(dá)目的蛋白。
[0007]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述羅氏沼郵模式識(shí)別蛋白LGBP的cDNA的 CDS (coding sequence)區(qū)域翻譯后的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述LGBP的cDNA的CDS區(qū)域的核巧酸序列如SEQ IDNO. 1 所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)質(zhì)粒pHAClSl是在商業(yè)化質(zhì)粒YCplaclSl 的SphI和EcoRV位點(diǎn)插入3個(gè)組氨酸標(biāo)簽得到的，詳見(jiàn)文獻(xiàn)：Analysesoftheeffectsof 民ck2pmutantsonPbs2p^-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifya MAPkinasedockingmotif，andunexpectedfunctionalinactivationduetoacidic substitutionofT379,MolGenGenomics, 2004, 271:208 - 219.
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主菌株為釀酒酵母GALl-ScRCHl，是將釀酒酵 母BY4741(Sc04153268_sl)菌株里的ScRCHl基因的啟動(dòng)子替換成GAL1啟動(dòng)子。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述釀酒酵母工程菌是按照如下方法構(gòu)建得到的： (1)W羅氏沼郵的CDNA為模板PCR擴(kuò)增或者直接化學(xué)合成，得到核巧酸序列如SEQIDNO. 1 所示的LGBP基因片段；（2)將LGBP基因片段克隆到表達(dá)質(zhì)粒pHAClSl上，得到重組表達(dá)質(zhì) 粒PHAC181-LGBP; (3)設(shè)計(jì)同源重組引物，對(duì)質(zhì)粒PHAC181-LGBP進(jìn)行擴(kuò)增，得到含有LGBP 基因的核巧酸片段，使用同源重組的方法，將該核巧酸片段整合至釀酒酵母菌株中GAL1啟 動(dòng)子下游。
[0012]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟（3)，還包括將菌株在YPG培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培 養(yǎng)化后，提取菌株蛋白，用于做WESTERN化0T檢測(cè)，目的蛋白表達(dá)的菌株則為構(gòu)建成功的 酵母工程菌。
[0013] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種高效表達(dá)羅氏沼郵模式識(shí)別蛋白LGBP的方法， 所述方法是使用所述釀酒酵母工程菌為生產(chǎn)菌株。
[0014] 所述方法是將釀酒酵母工程菌活化后，接種于YPG培養(yǎng)基中，在半乳糖的誘導(dǎo)下 培養(yǎng)化；所述YPG培養(yǎng)基含有D-半乳糖20g/l、蛋白腺20g/l、酵母提取物lOg/L。
[0015] 本發(fā)明還要求保護(hù)所述釀酒酵母工程菌生產(chǎn)得到的模式識(shí)別蛋白LGBP,W及其在 水產(chǎn)養(yǎng)殖或者水產(chǎn)動(dòng)物免疫飼料添加劑方面的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果：
[0017] (1)本發(fā)明構(gòu)建的釀酒酵母工程菌，可W實(shí)現(xiàn)羅氏沼郵模式識(shí)別蛋白LGBP的高效 表達(dá)、活性表達(dá)；本發(fā)明工程菌發(fā)酵得到的LGBP具有活力，誘導(dǎo)培養(yǎng)化后每血發(fā)酵液可得 到0. 064mg蛋白。
[0018] (2)本發(fā)明的工程菌為釀酒酵母工程菌，表達(dá)真核來(lái)源的LGBP，可W分泌經(jīng)正確 折疊和加工的蛋白質(zhì)；而且釀酒酵母具有在簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)；安全，可用于食品生 廣等優(yōu)點(diǎn)；
[0019] (3)本發(fā)明WPHAC181為載體、GALl-ScRCHl為宿主構(gòu)建釀酒酵母工程菌，實(shí)現(xiàn)了 羅氏沼郵模式識(shí)別蛋白LGBP的高效表達(dá)，W期增強(qiáng)甲殼類動(dòng)物對(duì)各種主要疾病和環(huán)境變 化的抵抗力，有效促進(jìn)其健康生長(zhǎng)。目前新型飼料蛋白源與飼料添加劑的研制與開(kāi)發(fā)己成 為促進(jìn)現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)，本發(fā)明的酵母工程菌不僅可W更進(jìn)一步對(duì)甲 殼類動(dòng)物重要免疫基因的蛋白功能進(jìn)行研究，也將為開(kāi)發(fā)新型免疫增強(qiáng)型飼料添加劑提供 科學(xué)依據(jù)及新方法。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1 :羅氏沼郵化LGBPcDNA擴(kuò)增條帶（1098bp);
[002。 圖2 :將羅氏沼郵化LGBPcDNA克隆至載體PHAC181上時(shí)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的酶切驗(yàn)證 化ine1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 17, 18, 20, 21，22, 23, 24 為正確的轉(zhuǎn)化子）； [0022] 圖3 :高保真酶PrimeSTARG)(L酶對(duì)重組質(zhì)粒pHAClSl-MrLGBP進(jìn)行擴(kuò)增 巧48化P);
[002引圖4:檢測(cè)引物檢測(cè)pHAClSl-MrLGBP與含GAL1啟動(dòng)子的菌株同源重組（同源重 組成功的條帶為138化P，Line2,3,4,6為正確的轉(zhuǎn)化子）；
[0024]圖5 :肥STERNBL0T檢測(cè)到Gal-pHAC181-MrLGBP蛋白表達(dá)，目的蛋白為45邸?！揪唧w實(shí)施方式】
[00巧]在本發(fā)明中，首先采用基因克隆技術(shù)，具體為：將羅氏沼郵RNA提取后，用反轉(zhuǎn)錄 試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用高保真PCR酶將目的基因片段化LGBP(MrLGBP即代表來(lái) 源于羅氏沼郵的LGB巧進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的基因片段與載體PHAC181連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞transTl中，涂布于LA平板上37°C過(guò)夜培養(yǎng)。LA平板上得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行 酶切驗(yàn)證及測(cè)序驗(yàn)證。其次，利用同源重組技術(shù)將帶有目的基因化LGBP的質(zhì)粒PHAC181整 合至釀酒酵母菌株中GAL1啟動(dòng)子下游，整合成功的菌株在YPG培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)化后，提 取蛋白，用于WESTERN化0T檢測(cè)。目的蛋白表達(dá)成功的菌株則為構(gòu)建成功的酵母工程菌。
[0026]LA培養(yǎng)基的組成：蛋白腺lOg/l、酵母提取物5g/L、化C1lOg/l、瓊脂12g/l，調(diào)抑 為 7. 0,Amp抗生素lOOmg/ml(120°C，20min)。
[0027]SD-Leu培養(yǎng)基的組成：含有酵母氮源（無(wú)AA) 1. 7g/l、硫酸錠5g/L、葡萄糖20g/ l^、10xAAmix(-ura，-leu，-his)100ml，100xUralOml'lOOxHis10ml，瓊脂 20g/L(120°C， 20min)。
[0028]YPG培養(yǎng)基的組成：D-半乳糖20g/l、蛋白腺20g/l、酵母提取物10g/L(115°C， 20min)。
[0029] 實(shí)施例1:釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建（基因克?。?br>[0030] 構(gòu)建高表達(dá)質(zhì)粒pHAClSl-MrLGBP，具體方法為提取羅氏沼郵組織RNA，反轉(zhuǎn)錄試 劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用高保真酶將目的基因片段化LGBP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，化LGBP 基因片段（CDS區(qū)域，不包含終止密碼子，共1098bp)，然后將此片段克隆到高表達(dá)載體 PHAC181的多克隆位點(diǎn)上，最后對(duì)正確的重組子進(jìn)行DNA測(cè)序，驗(yàn)證序列沒(méi)有發(fā)生突變，得 到重組高表達(dá)質(zhì)粒pHAClSl-MrLGBP。
[0031] 實(shí)施例2 :釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建（同源重組）
[0032] 根據(jù)構(gòu)建好的重組高表達(dá)質(zhì)粒pHAClSl-MrLGBP設(shè)計(jì)同源重組引物，利用高保真 PrimeSTAR G)(L酶對(duì)質(zhì)粒pHAClSl-MrLGBP進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功的長(zhǎng)片段整合至釀酒酵母菌 株中GAL1啟動(dòng)子下游。
[003引同源重組引物為F1、R1，序列如沈Q ID NO.3、SEQID NO.4所示：
tgccattagtgacc
[0037] CGATGATAAGCTGTCAAACATG
[0038] 基因同源重組（整合）的具體步驟為：
[0039] 1.挑活化的GALl-ScRCHl菌株單菌落，接種到3ml YPD培養(yǎng)基，30°C 22化pm培養(yǎng) 過(guò)夜。
[0040] 2.取300ul過(guò)夜培養(yǎng)物接種到4. 7ml2*YPD中，30°C培養(yǎng)4~化（達(dá)到0D600 = 0. 6-1.0);
[0041] 3.將5ml菌液分3管，室溫離屯、4000巧m，Imin，棄上清，再用1ml水重懸合并到1 個(gè)EP管中，3000巧m離屯、Imin，棄上清。
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