一種表達(dá)nad(p)h氧化酶提高重組枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種表達(dá)NAD(Ρ)Η氧化酶提高重組枯草芽抱桿菌乙酷氨基葡萄糖產(chǎn) 量的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙酷氨基葡萄糖是生物體內(nèi)的一種單糖，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、霉菌、植物W及 動(dòng)物體內(nèi)。在人體中，乙酷氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對(duì)修復(fù)和維持軟 骨及關(guān)節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酷氨基葡萄糖被廣泛作為藥物和營(yíng)養(yǎng)膳食添加 來(lái)治療和修復(fù)關(guān)節(jié)損傷。此外，乙酷氨基葡萄糖在化妝品和制藥領(lǐng)域也具有諸多應(yīng)用。目 前，乙酷氨基葡萄糖主要采用酸解郵殼或蟹殼中甲殼素生產(chǎn)，此方法產(chǎn)生的廢液對(duì)環(huán)境污 染較為嚴(yán)重，而且得到的產(chǎn)品易引起過(guò)敏反應(yīng)，不適宜海鮮過(guò)敏的人群服用。
[0003] 枯草芽抱桿菌度acillussubtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營(yíng)養(yǎng)化 學(xué)品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被FDA認(rèn)證為"generallyregardedassafe" (GRA巧安全級(jí)別。 因此，運(yùn)用代謝工程手段構(gòu)建重組枯草芽抱桿菌是生產(chǎn)食品安全級(jí)乙酷氨基葡萄糖的有效 途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明首先提供一種表達(dá)NAD(P)Η氧化酶的重組枯草芽抱桿菌，乙酷氨基葡萄糖 的產(chǎn)量提高。所述重組枯草芽抱桿菌WBSGN6-PxyiA-glmS-P43-GNAl為出發(fā)菌株，同時(shí)整合表 達(dá)內(nèi)源NAD(P)Η氧化酶。 陽(yáng)0化]所述BSGN6-PxyiA-glmS-P43-GMl，是WΒ.subtilisl68Δna評(píng)ΔgamPΔgamAΔnagA Δna濁Μ化Δpta: :lox72為宿主，分別W啟動(dòng)子PxyiA、P43控制glmS、GNAl的重組表達(dá)。 [0006] 所述整合表達(dá)是W強(qiáng)啟動(dòng)子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表達(dá)，通過(guò)同源 重組替換基因組上非必需區(qū)域skin。非必需區(qū)域skin在Bacillussubtilis168基因組NC_000964. 3 上的位置為 2654942-2701732bp。 陽(yáng)007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，重組枯草芽抱桿菌BSGN6-PxyiA-glmS-P43-GNAl的構(gòu) 建方'法參見(jiàn)文南犬Liu,Y.etal.Modularpathwayen邑ineerin邑ofBacillussubtilisfor improvedN-acetylglucosamineproduction.Metab.Eng. 23:42-52, 2014。
[0008] 所述NAD(P)H氧化酶的編碼基因yodc如NCBI-Gene10:939506所示。
[0009] 本發(fā)明還提供一種構(gòu)建所述重組枯草芽抱桿菌的方法，是 BSGN6-PxyiA-glmS-P43-GNA1為出發(fā)菌株，通過(guò)同源重組在基因組上W強(qiáng)啟動(dòng)子P43控制 NAD(P)Η氧化酶基因yodc表達(dá)。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用所述重組枯草芽抱桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙酷氨基葡萄糖的方 法，將37°C、20化pm下培養(yǎng)1化的種子W5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37°C、20化pm條 件下培養(yǎng)30h。
[0011] 重組枯草芽抱桿菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵：
[0012] 種子培養(yǎng)基（g/L):膜蛋白腺10,酵母粉5,化C1 10。
[0013] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):Glc60,酵母粉6,NH4SO47. 74,K2HPO4· 3&0 12. 5,KH2PO42. 5， CaC〇35，MgS〇43,微量元素 15ml/L。
[0014] 微量元素溶液（g/L) :MnS〇4· 5&0 1. 0, C0CI2·6H2O 0. 4, NaMo〇4· 2&0 0. 2， ZnS〇4· 7&0 0. 2, Aids · 6&0 0. 1，Cuclz · &0 0. 1，H3BO40.0 5,含5M肥1。
[001引培養(yǎng)條件：將37°C、20化pm下培養(yǎng)1化的種子W5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于 37°(：、200巧111條件下培養(yǎng)30}1。
[0016] 本發(fā)明用強(qiáng)啟動(dòng)子P43控制NAD(P)Η氧化酶基因yodc表達(dá)，構(gòu)建yodc表達(dá)盒，然 后通過(guò)同源重組用上述yodc表達(dá)盒替換基因組上非必需區(qū)域skin,整合表達(dá)內(nèi)源NAD(P) Η氧化酶W再生NAD(ΡΓ，調(diào)控胞內(nèi)NAD(P) 7NAD(P)Η比例，使胞內(nèi)氧化還原水平更加有利于 合成乙酷氨基葡萄糖。在使用半合成培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，表達(dá)NAD(P)H氧化酶的重 組枯草芽抱桿菌乙酷氨基葡萄糖的產(chǎn)量達(dá)到7.Ig/L，比整合表達(dá)前提高31%。本發(fā)明為進(jìn) 一步代謝工程改造枯草芽抱桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組枯草芽抱 桿菌構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 乙酷氨基葡萄糖的測(cè)定方法： 陽(yáng)0化]高效液相色譜（冊(cè)LC)檢測(cè)法：Agilent1260,RID檢測(cè)器，HPX-87H柱度io-Rad Hercules,CA)，流動(dòng)相：5mMH2SO4,流速 0.6mL/min，柱溫 35°C，進(jìn)樣體積為 10μL。
[0019] 實(shí)施例1構(gòu)建yodc表達(dá)盒
[0020] 參考 文南犬Genomeengineeringrevealslargedispensablere邑ions inBacillussubtilis.MolBiolEvol.2003Dec;20 (12) : 2076-90.化油 2003Aug29,同時(shí) 根據(jù)NCBI上公布的枯草芽抱桿菌度acillussubtilis168,購(gòu)自美國(guó)典型微生物保藏中 屯、，ATCCNo. 27370)基因組序列，設(shè)計(jì)yodc表達(dá)盒同源臂擴(kuò)增引物，左臂上下游引物分別 為：yodc-skinA-F:5, -GGTCCCTCGATGATTATCACTTTCATAAAATGC-3,和yodc-skinA-R:
[0021] 5 > -CTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCGATTGCTGTAGCTGTTGGTGTATTTGGAATTC-3 > ; 右臂上下游引物分別為：yodc-skin-R-F:
[0022] -CCGCTTTCAAAAGTATCAACTTGGCTGTAACTTAGACGCATTTTCCTATGAAAAAAGTCTTGATT TC-3' 和yodc-skin-R-R:5' -CGCTTTTCCTTCTCTGCCCGATAAAACT-3' ；運(yùn)用上述引物從枯草芽 抱桿菌度acillussubtilis168)基因組中擴(kuò)增yodc表達(dá)盒中包含的左臂和右臂。
[0023] 根據(jù)NCBI-GeneID:939506所示NAD(P)Η氧化酶編碼基因yodc序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò) 增NAD(P)H氧化酶編碼基因yodc,上下游引物分別為：P43-sk-yodc-F:
[0024] 5，-CGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGACGAATACTCTGGATGTTTTAAAAGCA CG-3,和P43-sk-yodc-R: 陽(yáng)0巧]5 >-GAAATCAAGACTTTTTTCATAGGAAAATGCGTCTAAGTTACAGCCAAGTTGATACTTTTGAAAGC GG-3';運(yùn)用上述引物從枯草芽抱桿菌度acillussubtilis168)基因組中擴(kuò)增yodc表達(dá) 盒中包含的NAD(P)Η氧化酶編碼基因yodc。
[0026] 根據(jù)NCBI上公布的p7Z6質(zhì)粒序列（NCBIaccessionno.抓541492)，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò) 增博來(lái)霉素抗性基因（zeo)，上下游引物分別為：yodc-skin-Z-F:5'-GAATTCCAAATACACCAA CAGCTACAGCAATCGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3，和P43yodc-sk-Z-R: 5，-ATTTAAAAGT TCAAGCGAAAACATACCACCTATCAGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'。
[0027] 根據(jù)NCBI上公布的pP4NMK質(zhì)粒序列（NCBI-GenBank:DQ264732. 1)，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò) 增強(qiáng)啟動(dòng)子P43,上下游引物分別為：yodc-sk-P43-F:5'-GTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCTGATA GGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTAAAT-3'和yodc-sk-P43-R: 5'-CGTGCTTTTAAAACATCCAGAGTAT TCGTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCG-3 '。
[0028] 通過(guò)融合PCR方法，將敲除框左、右臂、抗性基因及NAD(P)H氧化酶編碼基因融合 為表達(dá)盒。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)yodc表達(dá)盒構(gòu)建成功。
[0029] 實(shí)施例2重組枯草芽抱桿菌的構(gòu)建
[0030] 將構(gòu)建好的yodc表達(dá)盒轉(zhuǎn)化枯草芽抱桿菌度acillus subtilis 168)，通過(guò)博來(lái) 霉素抗性平板篩選、菌落PCR驗(yàn)證，確認(rèn)yodc表達(dá)盒整合成功，得到重組枯草芽抱桿菌。
[0031] 實(shí)施例3發(fā)酵生產(chǎn)乙酷氨基葡萄糖
[0032] 將37 °C、200巧m下培養(yǎng)12h的種子W5 %的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 °C、 20化pm條件下培養(yǎng)30h。發(fā)酵30h，發(fā)酵上清液中乙酷氨基葡萄糖含量達(dá)到7.Ig/L。通過(guò) 整合表達(dá)內(nèi)源NAD(P)Η氧化酶W再生NAD任Γ，調(diào)控胞內(nèi)NAD任)7NAD(P)Η比例，使胞內(nèi)氧 化還原水平更加有利于合成乙酷氨基葡萄糖。乙酷氨基葡萄糖的產(chǎn)量達(dá)到7.Ig/l，比整合 表達(dá)前提局31 %
[0033] 雖然本發(fā)明已W較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該W權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，以BSGN6-P xylA-glmS-P43-GNAl為出發(fā)菌株，在 基因組上整合表達(dá)內(nèi)源NAD (P)H氧化酶；所述BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl，是以B. subtilis 168 Δ nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagA Δ nagB Δ ldh Δ pta: : 1οχ72為宿主，分別以啟動(dòng)子PxylA、P43 控制glmS、GNAl的重組表達(dá)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述整合表達(dá)是以強(qiáng) 啟動(dòng)子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表達(dá)，通過(guò)同源重組替換基因組上非必需區(qū)域 skin。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述NAD (P) Η氧化酶的 編碼基因yodc的核苷酸序列如NCBI-Gene ID :939506所示。4. 一種構(gòu)建權(quán)利要求1-3任一所述重組枯草芽孢桿菌的方法，其特征在于，是以 BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNAl為出發(fā)菌株，以強(qiáng)啟動(dòng)子P43控制NAD⑵Η氧化酶基因yodc表 達(dá)，通過(guò)同源重組替換基因組上非必需區(qū)域skin。5. -種應(yīng)用權(quán)利要求1-3任一所述重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖的 方法，其特征在于，將37°C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以5%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于 37°C、200rpm條件下培養(yǎng)30h。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基按每L計(jì)含有：葡萄糖 60g，酵母粉 6g，NH4S04 7 . 74g，Κ2ΗΡ04 · 3H20 12. 5g，KH2P04 2. 5g，CaC03 5g，微量元素溶液 15ml;微量元素溶液按g/L計(jì)含有：MnS04 · 5H20L0,CoCl2 · 6H20 0· 4,NaMo04 · 2H20 0· 2， ZnS04 · 7H20 0· 2,A1C13 · 6H20 0· 1，CuCl2 ·H20 0· 1，H3B04 0· 05,含 5MHC1。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)NAD(P)H氧化酶提高重組枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明是以重組枯草芽孢桿菌BSGN6-PxylA-glmS-P43-GNA1作為出發(fā)菌株，首先用強(qiáng)啟動(dòng)子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表達(dá)，構(gòu)建yodc表達(dá)盒，然后通過(guò)同源重組用上述yodc表達(dá)盒替換基因組上非必需區(qū)域skin，整合表達(dá)內(nèi)源NAD(P)H氧化酶以再生NAD(P)+，調(diào)控胞內(nèi)NAD(P)+/NAD(P)H比例，使胞內(nèi)氧化還原水平更加有利于合成乙酰氨基葡萄糖。在使用半合成培養(yǎng)基的搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，表達(dá)NAD(P)H氧化酶的重組枯草芽孢桿菌乙酰氨基葡萄糖的產(chǎn)量達(dá)到7.1g/L，比整合表達(dá)前提高31％。為進(jìn)一步代謝工程改造枯草芽孢桿菌生產(chǎn)氨基葡萄糖奠定了基礎(chǔ)。
【IPC分類(lèi)】C12R1/125, C12N1/21, C12N15/75, C12P19/26
【公開(kāi)號(hào)】CN105255802
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510662252
【發(fā)明人】劉龍, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 李江華, 馬文龍, 武耀康
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月20日
【申請(qǐng)日】2015年10月14日